食源性致病菌檢測新方法

近年來食品安全得到了世界各國的普遍關注。每年向衛生部上報的食物中毒人數逐年遞增，且大部分是由食源性致病菌所引起。據世界衛生組織估計，全世界每年的食源性疾病患者中，70%都是由致病性微生物引起的。由此可見，食源性疾病與食品污染問題已成為世界范圍內舉足輕重的公共衛生問題。同時，GB 29921-2013《食品安全標準 食品中致病菌限量》于2014年7月1日實施，對食品中致病菌的規定更加嚴格。所以建立有效的食源性致病菌檢測體系，快速并且準確地完成對食品中致病菌的檢測已成為保障食品安全和防止疾病傳染的關鍵。

 隨著生物技術的進步，除了傳統檢測方法外，在食源性致病菌檢測領域出現了許多比傳統方法更快捷、敏感性更好的新技術，如免疫學檢測技術和分子生物學檢測技術等。本文對目前國內外食源性致病菌的檢測方法進行歸納和綜述，并對不同方法進行闡述和分析。

免疫學方法

 檢測食品中致病菌的免疫學方法主要有免疫擴散法、反向間接凝血試驗（即HA）、反向被動乳膠凝集試驗（RPLA）、放射免疫法（RIA）、免疫熒光技術（IFT）、酶聯免疫吸附法（ELISA）等。

 最初應用的免疫學方法為免疫擴散法，它主要分為單向免疫擴散試驗和雙向免疫擴散試驗，但這兩種方法的檢出靈敏度較低，檢測的食品標本需要濃縮，操作量大、工作繁瑣，因而未能推廣。RIA的應用將同位素測定的高靈敏性和抗原抗體反應的高特異性有效地結合在一起，使得其檢測的靈敏度和特異性均有所提高而且具有簡單、快速的特點。RIA測定食品標本不需要濃縮，1~2d內可出結果，檢測各種食品中的金黃色葡萄球菌的靈敏度為1~10ng/g,但該方法存在放射性污染和需要專門的防護設備、檢測儀器等問題，也不易推廣。

 免疫熒光技術（IFT）是在將不影響抗原抗體活性的熒光色素標記在抗體（或抗原）上，與其相應的抗原（或抗體）結合后，在熒光顯微鏡下呈現特異性的熒光反應，可用來對葡萄球菌、大腸桿菌0157、沙門氏菌和單核增生李斯特氏菌等進行快速檢測。此方法的主要特點是特異性強、敏感性高、速度快。但存在一些不足尚未完全解決，如非特異性染色問題，結果判定的客觀性不足，技術程序比較復雜。

 ELISA方法是一種敏感、快速、簡單的方法，應用較廣。酶聯免疫吸附技術的基本原理是將抗原或抗體預先吸附于固相載體表面，再加入受檢樣品和酶標抗體，進行免疫酶染色，經固相載體上的酶催化產生顏色變化，從而判斷受檢樣品是否含有目的抗原。同時通過分析有色產物量可以確定樣品中待測物質的含量。國內外學者采用酶聯免疫吸附技術對不同的細菌進行檢測，實驗結果表明ELISA法對多種食源性致病菌的靈敏度和特異性較好。但ELISA對試劑的選擇性高，很難同時分析多種成分，且對結構類似的化合物有交叉反應。

基因芯片技術

 基因芯片技術是上個世紀末誕生的一項新型生物技術。它是將各種基因寡核苷酸點樣于芯片表面，微生物樣品DNA經PCR擴增后制備熒光標記探針，然后再與芯片上寡核苷酸點雜交，通過掃描儀定量和分析熒光分布模式來確定檢測樣品是否存在某些特異微生物。其檢測致病菌原理為：選擇細菌的共有基因作為靶基因，用一對通用引物進行擴增，再利用芯片上的探針檢測不同細菌在該共有基因上的獨特堿基，從而區分不同的細菌，此法還可以通過向寡核苷酸探針陣列中添加相應的探針來逐步擴大基因芯片的檢測范圍，并通過增加和調整探針來逐步提高基因芯片的準確性。基因芯片技術理論上可以在一次實驗中檢出所有潛在的致病菌，也可以用同一張芯片檢測某一致病原的各種遺傳學指標，檢測的靈敏度、特異性和快速便捷性都很高，因而在致病原分析檢測中有很好的發展前景。

核酸探針技術

 核酸探針檢測技術的依據是核酸雜交，其工作原理是兩條堿基互補的DNA鏈在適當的條件下可以按堿基互補配對原則，形成雜交DNA分子。已知每個生物的各種性質和特征都是由其所含的遺傳基因所決定，因此，從理論上講，任何一個決定生物體特定生物學特征的DNA序列都應該是獨特的。通過將微生物的特征基因的一條DNA鏈進行標記，即可制成DNA探針。標記的方法可分為兩種：放射性標記探針和非放射性標記探針。放射性探針是以同位素為標記物，常用的同位素包括32P、3H、35S,通過放射自顯影檢測分析結果；非放射性探針是以生物素、酶和熒光素等為標記物，雜交后通過酶催化底物顯色反應、熒光顯微鏡或熒光儀檢測雜交結果。用大腸桿菌編碼葡萄糖醛酸酶的uidA基因設計探針，用以檢測食品中的總大腸桿菌。

光學生物傳感技術

 光學生物傳感器源于傳統的物理傳感器，它將反應產生的化學信號轉換為光信號，其的優點是抗外界干擾能力強。光學生物傳感器的檢測模式有吸收、反射、化學發光、熒光和磷光等，在致病菌檢測中最有應用前景的技術包括表面等離子共振技術等。表面等離子共振技術是一種基于反射光譜的非標記檢測技術。它將已知生物分子固化在幾十納米厚的金屬膜表面，加入能夠與之結合的目標生物分子，由此引發的光學信號隨機被表面等離子共振傳感器轉化為電信號進行檢測分析。

聚合酶鏈式反應技術

 聚合酶鏈式反應技術是在體外合適條件下，以DNA為模板，以一對人工合成的寡核苷酸為引物在耐熱DNA聚合酶作用下特異性擴增目的DNA片段的技術。近年來應用PCR技術檢測食源性致病菌的技術有很多，如常規PCR、多重PCR、實時熒光定量PCR、逆轉錄PCR、不對稱PCR、免疫PCR、套式PCR和電化學發光PCR等。多重PCR是在常規PCR基礎上改進并發展起來的一種DNA擴增技術。多重PCR在同一反應體系中同時加入多對引物，擴增多條目的DNA片段，所以可以同時檢測多個目標菌。相對于傳統檢測方法，多重PCR檢測技術可以極大地縮短檢測時間，且操作簡單、特異性和敏感度較高。因此采用多重PCR方法檢測多種細菌一直是細菌快速檢測的研究熱點。但是多重PCR技術在實際的檢驗工作中還存在一些問題：如提取得到的DNA片段可能不完整，多組引物之間的相互干擾，高濃度模板對低濃度模板產生競爭性抑制以及樣品中可能含有PCR抑制物質等。

 實時熒光定量PCR技術于1996年由美國Applied Biosystems公司推出。實時熒光PCR是在反應體系中加入熒光分子，通過熒光信號的強弱來實時反應模板的擴增量，通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。實時熒光PCR技術采用全密閉管檢測，不僅實現對DNA模板定量，還能避免電泳帶來的誤差和污染，具有重復性好、自動化程度高、實時性強和準確性高等特點。實時定量PCR類型主要有探針類和非探針類兩種。探針類是利用與靶序列特異雜交探針指示擴增產物增加，特異性好；而非探針類是利用染料或特殊設計引物指示擴增產物增加，特異性不強，但簡便易行。目前在國內外實時熒光定量PCR廣泛應用于基因表達研究、病原體檢測等領域。

 食品安全問題關系到國計民生，隨著經濟社會的不斷發展，必然會對食源性致病菌的檢測提出越來越多的要求。傳統的細菌培養、分離、鑒定與檢測的技術耗時長且檢出敏感性差。但使用傳統檢測方法可獲得供后續研究的致病菌菌落，所以該方法仍是食源性致病菌檢測的最基本檢驗方法。

 對于食品中的致病菌檢測來說，依靠單一的手段已不能滿足現階段的檢測要求。多種技術的聯用可大大提高檢測的靈敏度，并減少檢測時間。隨著微生物學、生物化學和分子生物學等學科的飛速發展，各種多功能微生物檢測系統的研發逐步成為熱點。3M分子檢測系統將環介導等溫核酸擴增技術（LAMP）和生物熒光實時檢測技術（BART）結合在一起，可實現在分子層面上對食源性致病菌準確、高效的檢測。隨著人們對食品微生物認識的逐步深入，相信會有越來越多的食源性致病菌分析方法和檢測技術應用到實際生活中。