中國主要葡萄酒產區酒酒球菌糖苷酶活性研究

 喬慧1 , 盧 柯 1 ,楊世玲 1 ,薛楚然 1 ,劉樹文 1,2*（ 1. 西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西 楊凌 712100;2. 陜西省葡萄與葡萄酒工程技術研究中心，陜西 楊凌 712100）

 摘要：葡萄酒中的乳酸菌， 尤其是一些酒酒球菌可產糖苷酶， 在蘋果酸乳酸發酵 （Malolactic Fermentation,MLF）過程中作用于香氣前體，釋放出揮發性的香氣物質，從而增加葡萄酒的香氣復雜性。本試驗以中國5 個釀酒產區 19 株釀酒特性優良的酒酒球菌和一株商業菌株為試驗材料，通過測定五種糖苷酶活性，對其中 5 株糖苷酶活性高的菌株研究其在葡萄酒環境中糖苷酶的酶學性質。 結果表明 20 株菌在相應底物作用下均含有可檢測的糖苷酶活性，不同菌株酶活性差異顯著，地區間差異不顯著。最適 pH 為 4.0,最適溫度為45℃，乙醇、葡萄糖和果糖在低濃度時有促進作用，高濃度時抑制作用顯著，但各種酶活性表現為菌株依賴性。在模擬酒條件下，菌株相對酶活僅是菌株酶活性的 9.805%-32.331%.總之，在所選菌株中，SD-1f在葡萄酒環境中的糖苷酶活性。

關鍵詞：葡萄酒；酒酒球菌；糖苷酶活性

 在葡萄酒釀酒體系中， 兩類微生物發揮重要作用， 即酵母菌和乳酸菌， 分別進行酒精發酵 （AlcoholFermentation, AF）和蘋果酸乳酸發酵（Malolactic Fermentation, MLF） .釀酒酵母可產多種酶，但糖苷酶并不是主要的酶，且在 AF 過程中，糖苷酶活性受葡萄糖的顯著抑制 [1] .而一些非釀酒酵母具有大量的 β-葡萄糖苷酶活力，但僅局限于 AF 開始階段，隨接種釀酒酵母的生長，非釀酒酵母的數量急劇下降 [2] .因此，酵母菌對糖苷類香氣的釋放作用有限。

 乳酸菌對葡萄酒中香氣的形成具有重要影響，在MLF過程中可增加香氣的復雜性，因為酒酒球菌能夠較好地適應葡萄酒中的低pH和高酒精度等環境，在多數MLF過程中起主導作用 [3] .研究表明，酒酒球菌可產糖苷酶，通過水解葡萄糖苷（香氣前體）釋放香氣物質，增加并改良葡萄汁和葡萄酒的花香和果香，并產生濃郁、自然的葡萄酒香氣 [4] .Guilloux-Benatier et al.（1993）首次報道了關于酒酒球菌β-D-葡萄糖苷酶的研究 [5] ,目前已經有大量相關研究 [6-11] .Grimaldi 等在2000年首次提出多酶的存在，為了證實這一猜想，他們利用其它底物對22株商業菌株的專一酶活性進行測定，證實酒酒球菌中存在葡萄糖苷酶、 木糖苷酶、 阿拉伯糖苷酶和低含量的鼠李糖苷酶， 盡管糖苷酶的種類是菌株依賴性的 [12] .

 葡萄漿果中存在著游離態和結合態兩類香氣物質，游離態香氣物質可以直接從葡萄酒中揮發出來，使人產生嗅覺反應；結合態香氣物質沒有香氣，必須經過分解釋放出游離態呈香物質才能產生香氣 [13] .通常，后者含量比前者要豐富得多。結合態香氣物質由糖基和糖苷配基組成，糖基通常是 β-D-葡萄糖、α-D-葡萄糖、β-D-木糖、β-芹菜糖、α-L-阿拉伯糖和 α-L-鼠李糖 [14] ;糖苷配基包括單萜烯、C13-降異戊二烯、苯衍生物和脂肪族化合物，是對葡萄酒香氣有貢獻的物質 [14-16] .其中萜烯類化合物是一些葡萄酒香氣中最重要的組成部分， 例如在麝香葡萄、 瓊瑤漿、 雷司令和瑪爾維薩葡萄酒中 [12, 17] .

 葡萄酒中結合態香氣前體可通過酸解、熱水解或酶解釋放出揮發性的糖苷配基 [12, 15] ,其中酶解是一種更接近于自然、溫和的方法，極具商業化應用前景，一般采用酶解的方法來增強葡萄酒香氣 [4, 18] .糖苷酶對葡萄糖苷的水解，可一步反應，也可兩步反應（順序水解）。在順序水解模式中，首先一種外切糖苷酶（α-L-鼠李糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、β-D-芹菜糖苷酶或 β-D-木糖苷酶）切斷糖內連接，釋放出相應的糖和一個 β-D-葡萄糖苷，隨后 β-D-葡萄糖苷酶催化 β-D-葡萄糖苷的水解，釋放出相應的糖苷配基和葡萄糖；在一步反應模式中，雙葡萄糖苷酶催化糖苷配基與二糖苷之間的連接，從而釋放出相應的糖苷配基和二糖 [19] .α-D-葡萄糖苷酶可降解酵母菌衍生的大分子物質，為乳酸菌生長提供營養物質 [5, 16] .

 綜上所述， 葡萄酒中的酒酒球菌可通過糖苷酶水解葡萄糖苷釋放香氣物質， 影響葡萄酒香氣質量。盡管許多學者已經證明乳酸菌能夠促進香氣化合物釋放， 但關于參與反應的酶的種類的知識卻相對較少 [20] ,且僅有少量菌株對多種底物有持續穩定的高活性。因此，研究各種釀酒參數和葡萄酒環境對糖苷酶活性的影響，可在菌株篩選時預測菌株在釀酒中發揮的作用以及它對葡萄酒香氣特性的影響，減少乳酸菌對葡萄酒產生負面影響，為生產優質葡萄酒奠定基礎。

1  材料與方法

1.1 供試菌株

 菌株來源于西北農林科技大學葡萄酒學院保存的中國 5 個釀酒產區的優良酒酒球菌，包括山東 7株（SD-1a,SD-2a,SD-1b,SD-1g,SD-1f,SD-2gh,SD-2h） 、新疆 3 株（XJ-2a,XJ-2b,XJ-3a） 、陜西 2 株（SX-1b,SX-1a） 、河北 4 株（HB-1a,HB-1b,HB-1c,HB-2b） 、寧夏 3 株（NX-1e,NX-4b,NX-3g） ,和一株商業菌株（31 DH） .

1.2 試劑

 ATB 培養基：蛋白胨 10g,酵母浸粉 5g,葡萄糖 10g,MgSO 4 ?7H 2 O 0.2g,MnSO 4 ?4H 2 O 0.05g,鹽酸半胱氨酸 0.5g,番茄汁 25%（v/v） ,蒸餾水定容至 1000mL,pH 調至 4.8,121℃滅菌 20min.pNP-βGlu、pNP-aGlu、pNP-βXyl、pNP-aRha、pNP-aAra 1 購買自 Sigma 公司，其它試劑均為分析純。

1.3 儀器與設備

 UV-2450 紫外分光光度計，Eppendorf Centrifuge 5417R 型冷凍離心機，10mm 狹縫比色皿，MJ-250B 恒溫培養箱，AIR TECH 超凈工作臺，HH-4 數顯恒溫水浴鍋。

1.4 試驗方法

1.4.1 菌株活化

 酒酒球菌在 ATB 培養基 26℃2 次連續活化培養，隨后接種于 ATB 液體培養基上擴大培養。通過測定 600nm 下的吸光值了解細菌的生長情況，當 OD 600 接近 1 時，將培養液放置于 4℃冰箱中過夜。

1.4.2 酒酒球菌糖苷酶活性測定

 試驗改進了 Grimaldi 等（2005）所用的酒酒球菌糖苷酶活性測定方法 [13, 17] ,反應總體積為 80μL,其中每個反應包括 McIlvane 緩沖液 40μL,菌懸液 20μL,底物溶液 20μL.

 菌懸液制備：從 ATB 擴大培養基中吸取 3mL 培養液，離心 5min（10000rpm,4℃）收集菌體，用 0.85% NaCl 溶液重懸，重復 2 次操作，使菌體密度 OD 600 ≈0.5,并測定菌密度 OD 600 .McIlvane 緩沖液制備：由 0.1mol/L 檸檬酸和 0.2mol/L 磷酸氫二鉀配制而成，緩沖液濃度為0.2mol/L,PH 為 4.0.

 底物溶液制備：分別配制對硝基苯基 β-D-葡萄糖苷（pNP-βGlu） 10mmol/L,對硝基苯基 α-D-葡萄糖苷（pNP-aGlu）10mmol/L,對硝基苯基 β-D-木糖苷（pNP-βXyl）7.5mmol/L,對硝基苯基 α-L-鼠李糖苷（pNP-aRha）7.5mmo/L,對硝基苯基 α-L-阿拉伯糖苷（pNP-aAra）7.5mmol/L.

 反應體系混合均勻，于 37℃下反應 1h,隨后立即加入 160μL 的 Na 2 CO 3 （0.5mmol/L）終止反應并顯色，放置至室溫，2500r/min 離心 18min ,吸取 200μL 上清液至另一離心管中。在 400nm 下用UV-2450 紫外分光光度計測定上清液的吸光值（OD） ,重復 3 次。空白為 McIlvane 緩沖液替代菌懸液的反應體系，其他處理相同。

 酶活定義： 以各種糖苷酶對應的糖苷為底物， 1min 每 1g/L 菌體細胞水解相應底物生成 1μmol/L 對硝基苯酚（pNP）的酶活力定義為一個酶活力單位 U.

1.4.3 糖苷酶酶學性質研究

1.4.3.1  pH 值對糖苷酶活性的影響

 用 1mol/L HCL 或 NaOH 調節 McIlvane 緩沖液，設定 pH 值梯度為 2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0,在上述反應條件下測定酶活。

1.4.3.2  溫度對糖苷酶活性的影響

 通過恒溫水浴鍋設定溫度梯度，分別設為 15、25、35、45、55℃，在上述反應條件下測定酶活。

1.4.3.3  乙醇、葡萄糖和果糖對糖苷酶活性的影響

 分別設定乙醇濃度（4、8、12、14%（v/v） ） 、葡萄糖濃度（0.1、0.4、0.75、2%（w/w） ）和果糖濃度（0.1、0.4、0.75、2%（w/w） ） ,在上述反應條件下測定酶活，對照為未加酒精、葡萄糖和果糖所測的酶活，即菌株糖苷酶活性測定中所測得的酶活，設定其相對酶活為 .

1.4.3.4  模擬酒對糖苷酶活性的影響

 模擬酒配方為 [16] :酒精 11%（v/v） 、葡萄糖 2g/L、果糖 2g/L、pH 3.5, 20℃反應 1h 后測定酶活，對照為菌株糖苷酶活性測定中所測得的酶活，設定其相對酶活為 .

2  結果與分析

 1 pNP-βGlu、pNP-aGlu、pNP-βXyl、pNP-aRha、pNP-aAra 為底物縮寫形式，分別表示對硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷，對硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷，對硝基苯酚-β-D-木糖苷，對硝基苯酚-α-L-鼠李糖苷和對硝基苯酚-α-L-阿拉伯糖苷。

2.1 酒酒球菌的糖苷酶活性

 以各糖苷酶相應的糖苷為特異性底物，在 37℃下反應 1h,活性測定結果見表 1,酶活力單位為μmol/（g·min）。

 由表1可知，20株酒酒球菌在五類糖苷酶相應糖苷底物作用下， 都有可檢測的糖苷酶活性 （0.815~50.345 μmol/（g·min）） .β-D-葡萄糖苷酶的平均酶活為 6.197μmol/（g·min），菌株間差異顯著，酶活（NX-3g）是酶活的 3 倍，其中商業菌株 31 DH 的酶活力為 7.733 μmol/（g·min），在所測菌株中酶活相對較高。 對于 α-D-葡萄糖苷酶活性， 平均酶活為 39.126 μmol/（g·min）， 是 β-D-葡萄糖苷酶的 6 倍，且酶活是 β-D-葡萄糖苷酶酶活的 5 倍，菌株間的差異顯著。此外，這兩種酶活性沒有直接聯系，例如 XJ-1a、XJ-3a 兩種酶活性都很低，而一些菌株具有較高的 β-D-葡萄糖苷酶、較低的 α-D-葡萄糖苷酶活性（NX-3g,SX-1a） ,其他菌株也有相反的情況（SD-1g,SD-2a） .其他三種糖苷酶的測定也可以得出：β-D-木糖苷酶的平均活性是 β-D-葡萄糖苷酶活性的 2 倍，α-L-阿拉伯糖苷酶和 α-L-鼠李糖苷酶的活性都較小，但所有菌株都可以檢測得到。由此可以推測，5 類糖苷酶活性的總體趨勢為：α-D-葡萄糖苷酶>β-D-木糖苷酶>β-D-葡萄糖苷酶>α-L-阿拉伯糖苷酶≥α-L-鼠李糖苷酶。

 同時通過對地區間的差異顯著性分析， 可以得出對底物 pNP-βGlu、 pNP-αGlu、 pNP-βXyl、 pNP-αAra和 pNP-αRha 地區間顯著性分別為 0.293、0.109、0.117、0.109 和 0.874,在 5%水平上差異不顯著。因此地區不能作為區分菌株糖苷酶活性高低的依據。

 眾所周知酒酒球菌處于葡萄酒惡劣、復雜的環境中，如低 pH、低溫、高乙醇濃度及葡萄糖和果糖等因素都可能對糖苷酶的活性產生影響， 因此有必要對菌株在單因素條件糖苷酶活性的變化進行研究。本試驗中以 β-D-葡萄糖苷酶和 α-D-葡萄糖苷酶為依據，根據表 1 測定結果，選取酶活性高的 5株菌（NX-3g、SX-1a、SD-1f、HB-1c、31 DH） ,研究各因素對酶活性的影響。

2.2 pH 對糖苷酶活性的影響

 葡萄酒的 pH 是影響酒酒球菌生存與生長最重要的因素之一，同樣的也會影響到糖苷酶的活性。由圖 1 可知，從總體上來看，pH 值對 5 株酒酒球菌糖苷酶活性有顯著影響。對 β-D-葡萄糖苷酶，菌株在 pH 4.0 時酶活性，酶活是酶活的 7 倍。對 α-D-葡萄糖苷酶，在 pH 2.5 時，酶活性幾乎為零；隨 pH 升高，抑制作用減弱，在 4.0 時達；大于 4.0 時，酶活性緩慢下降。對其他三種酶可以看出：在 pH 4.0 和 5.5 有兩個峰值，在 pH 小于 4 時，菌株糖苷酶活性受顯著抑制。因為葡萄果實中含有大量的與鼠李糖連接的香氣物質，鼠李糖苷酶在釀酒過程中發揮重要作用 [21] ,但從圖中可以看出其對底物的水解作用較弱，酶活僅為 5.419μmol/（g·min）。這一參數而言，各酶活性是菌株依賴性的。葡萄酒的 pH 通常為 3.0-4.0,在此 pH 時糖苷酶活性受抑制，只有低含量的酶活性。

2.3 溫度對糖苷酶活性的影響

 考慮到釀酒過程中溫度通常是在 10-30℃，因此測定了溫度對糖苷酶活性的影響。雖然不同菌株的酶活性不同，但是隨溫度變化的總體趨勢基本一致，所以選擇 2 株菌（SX-1a、SD-1f）為代表，測定結果見圖 2.由圖中可以看出，五種酶的最適溫度都在 45℃左右，在溫度小于最適溫度時，隨溫度升高酶活性相應增加，隨著溫度接近 55℃所有糖苷酶活性迅速下降。MLF 過程溫度通常控制在20-23℃，在此溫度下兩株菌只有較低的酶活性。

2.4 乙醇、葡萄糖和果糖對糖苷酶活性的影響

 乙醇和糖（包括葡萄糖、果糖）通常被認為對糖苷酶活性有抑制作用 [15, 22] .因此，本試驗測定了這些物質對糖苷酶的影響，測定結果見圖 3.

 葡萄酒中乙醇濃度通常小于 15%（v/v）， 大量的研究已經證明乙醇對糖苷酶活性的影響取決于菌株和乙醇濃度 [7, 22] . 目前有兩種乙醇對糖苷酶活性影響的機制， 一種認為乙醇作為一種關鍵糖基中間物，當它的濃度增加時， 可以增加此酶的糖基轉移酶的反應速率， 另一種解釋認為乙醇可能改變膜通透性，促進細胞內酶和底物的接觸 [22] ,酶活性下降可能由酶變性失活引起 [15] .由圖 3 可知，在 4%乙醇濃度時， SD-1f 的 β-D-葡萄糖苷酶活性高于對照，其他菌株都低于對照，說明菌株對乙醇的耐受性是菌株依賴性的，隨著乙醇濃度升高，酶活性迅速下降；所有菌株 α-D-葡萄糖苷酶在設定乙醇濃度下都受到抑制；低濃度（4%和 8%（v/v） ）可促進 β-D-木糖苷酶活性；所有菌株 α-L-鼠李糖苷酶和 α-L-阿拉伯糖苷酶在測定濃度條件下也受到抑制，后者受抑制程度更顯著，SX-1a 在 14%（v/v）抑制程度大于95%.這一參數而言，可以推斷 SD-1f 在葡萄酒乙醇濃度 12%和 14%（v/v）下菌株酶活性保持。

 大量研究已經證明葡萄糖和果糖會降低多種來源菌株的糖苷酶活性 [6, 23] .葡萄糖即使在測定濃度 0.1%（w/v）時，五種糖苷酶活性都受到不同程度的抑制，β-D-葡萄糖苷酶下降幅度為 12-40%,α-D-葡萄糖苷酶和 α-L-鼠李糖苷僅是對照的 50%.與本試驗測定結果一致，Williams et al.（1993）證明葡萄酒中葡萄糖含量即使在殘糖濃度仍對糖苷酶活性有抑制作用 [24] .隨葡萄糖濃度增加，酶活性抑制作用增強，但不呈線性關系，其中 α-D-葡萄糖苷酶和 β-D-木糖苷酶下降不顯著，其他三種酶活性受抑制顯著。從總體來看，SD-1f 受影響最小，NX-3g 受影響。

 與葡萄糖類似，果糖的典型反應也是抑制，盡管從總體來看降幅小于葡萄糖，但不同菌株受果糖的影響也不同。對菌株 31 DH 和 NX-3g,即使在濃度（0.1%（w/v） ） ,β-D-葡萄糖苷酶活性也受到抑制，而菌株 SX-1a 和 SD-1f 酶活性增強。在測定濃度下，所有菌株的 α-D-葡萄糖苷酶活性都受到顯著抑制，僅是對照的 50%,但隨濃度增加活性減小程度不顯著。對 β-D-木糖苷酶，菌株 SD-1f 表現最為突出，基本上不受果糖的影響，其他菌株都受果糖的抑制，降幅小于 α-D-葡萄糖苷酶。α-L-阿拉伯糖苷酶和 α-L-鼠李糖苷酶在低濃度（0.10%和 0.40%（w/v） ）時，一些菌株表現為促進，隨果糖濃度升高至 2.00%時，酶活分別僅是對照的 44%和 46%.

2.5 模擬酒對糖苷酶活性的影響

 在大部分情況下，葡萄酒中酒酒球菌通常都處于上述各因素的綜合作用下。為了研究這些參數的綜合作用，測定了在模擬酒環境下菌株的糖苷酶活性，測定結果見表 2.從表中可以看出，菌株的相對酶活僅是菌株酶活性的 9.805%-32.331%,從總體來看，菌株 SD-1f 受模擬酒環境條件影響最小，與單因素測定結果一致，β-D-葡萄糖苷酶活性為 2.422μmol/（g·min），是對照的 31.046%.與本試驗測定結果類似的，Grimaldi et al.報道多種釀酒參數（pH、乙醇、糖和溫度）共同作用會增強對糖苷酶的抑制作用，同時不同菌株對參數的反應也不同 [7, 22] .

3  結論

 本研究證明酒酒球菌不僅普遍產糖苷酶，而且糖苷酶種類不局限于 β-D-葡萄糖苷酶。20 株酒酒球菌在五類糖苷酶相應糖苷底物作用下， 都有可檢測的糖苷酶活性， 且五類糖苷酶活性的總體趨勢為：α-D-葡萄糖苷酶>β-D-木糖苷酶>β-D-葡萄糖苷酶>α-L-阿拉伯糖苷酶≥α-L-鼠李糖苷酶。α-D-葡萄糖苷酶活性，為乳酸菌生長提供營養物質，促進生長；β-D-葡萄糖苷酶是提升葡萄酒香氣的關鍵酶，在篩選菌株時應優先考慮；α-L-鼠李糖苷酶和 α-L-阿拉伯糖苷酶活性很低，而葡萄果實中卻含有較多的與鼠李糖連接的二糖類化合物，抑制了香氣的釋放。地區間差異分析結果為不顯著，不能作為區分菌株糖苷酶活性的依據。

 通過對潛在的抑制參數 pH、溫度和葡萄酒組分（乙醇、葡萄糖和果糖）對五種糖苷酶活性影響的研究，結果表明影響作用介于輕微促進和強烈抑制之間。五種糖苷酶在 pH 4.0 都有一個峰值，在葡萄酒的 pH 值范圍內，只有較低的活性；糖苷酶最適溫度都在 45℃左右；乙醇、葡萄糖和果糖在低濃度時有促進作用，高濃度時抑制作用顯著，但各種酶活性表現為菌株依賴性。通過測定模擬酒條件下菌株的糖苷酶活性，有助于了解工業生產中酶的潛在活性。從本試驗研究結果來看，SD-1f 在葡萄酒環境中糖苷酶活性。

 總之，只有少數酒酒球菌對測定的底物表現出持續高活性，而葡萄酒的組成成分相當復雜，在實際生產中菌株酶活性受環境的綜合影響更大， 所以在菌株篩選時需要慎重考慮菌株在葡萄酒環境中的生長狀況和它對葡萄酒糖苷修飾方面的應用， 同時也突出了在后續工作中進行糖苷酶純化接種發酵的重要性。（文章來源：食品科學雜志）

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