糧食及其制品中真菌毒素的檢測方法

□ 中檢環貿生物技術（北京）有限公司 供稿

 真菌毒素是真菌產生的有毒次級代謝物，它廣泛存在于糧油食品和飼料中，對人類和動物有害。一種真菌可能產生多種毒素，多種真菌可能產生同一種毒素。通常糧食或飼料中的真菌毒素并非單獨存在，可能以一種或數種毒素為主，當不同毒素同時存在時，真菌毒素的毒性有累加效應（如黃曲霉毒素和赭曲霉毒素、嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮等），但并非是相加或相乘的關系。真菌毒素的毒性變化很大，它取決于毒素的種類、數量、攝入量、持續攝入時間、環境因素（包括環境衛生、空氣質量、溫度、濕度）等。\目前，全世界已經發現了400多種結構不同的真菌毒素，其中已經被分離鑒定的有20多種，危害較大的主要有黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素、赭曲霉毒素A、伏馬毒素和T2/HT2毒素等。其中，黃曲霉毒素是天然物中致癌性最強的毒素，被世界衛生組織（WHO）的癌癥研究機構劃定為1類致癌物，也是世界各地農產品及食品中最易受其污染的一種真菌毒素。據聯合國糧農組織估計，全世界谷物供應的25%受真菌毒素污染，這些真菌毒素會通過被污染的谷物、飼料和由這些飼料喂養的動物所提供的動物性食品進入人們的食物鏈，從而對人畜表現出致癌性、遺傳毒性和致畸性。目前，全世界已有100個規定了糧食中主要真菌毒素的限量，我國GB 2761-2011也明確規定了食品中真菌毒素的限量。因此，準確檢測真菌毒素含量的技術手段變得極為重要。

 真菌毒素的檢測方法有很多種，比較經典且已經形成標準或行業標準予以實施的檢測方法主要包括高效液相色譜法（HPLC）、液質聯用法（LC-MS）、薄層層析法（TLC）、免疫親和層析凈化熒光光度法、酶聯免疫法、膠體金檢測條法等。

高效液相色譜法和液質聯用法

 高效液相色譜法是目前糧油食品中真菌毒素定量檢測的主要方法，其檢測過程一般包括樣品粉碎、提取、過濾、凈化和進樣分析等步驟。由于高效液相色譜法對樣品的純度要求較高，因此凈化過程是檢測中的關鍵步驟。在我國新近頒布的真菌毒素檢測標準方法中，主要采用免疫親和柱凈化-高效液相色譜法，該方法已經成為標準的主流方法。

 由于真菌毒素的種類較多，其化學性質各有特點，如有些對紫外光有響應，有些對熒光有響應，而有些只能衍生后進行檢測，因此傳統的液相色譜法很難同時檢測多種毒素，而同種糧油或其制品常易被多種毒素同時污染，因此發展出了可同時測定多種真菌毒素的液質聯用法（HPLC-MS）。\中檢環貿生物技術（北京）有限公司的Helix六合一真菌毒素免疫親和柱適用于多種樣品類型，如糧食谷物、堅果、食用油、奶粉、嬰幼兒食品和香辛料等，能同時分離和純化標準中規定的6種真菌毒素（AFLA+ZEN+DON+OTA+FUM+T2/HT2），將免疫親和柱的高效純化優勢與質譜多種分析物同時檢測的特點有效結合，樣品處理液可直接應用于HPLC、LC-MS/MS、ELISA等多種檢測方法。

薄層色譜法（TLC）

 薄層色譜法是20世紀60年代發展起來的一種平面色譜技術，該方法針對不同樣品，用適當的有機溶劑將待測毒素從樣品中提取出來，經純化后在薄層板上展開層析、分離，利用真菌毒素的熒光特性，與標準品比較進行定性和定量。該方法成本低，對設備和檢測人員要求較低，但是該方法度低、操作過程復雜、分析結果的可重復性和再現性差，并且檢測過程中需要使用高濃度的真菌毒素標準品（真菌毒素毒性較強，易對人體造成傷害，尤其是黃曲霉毒素，能夠致癌），因此，近幾年薄層色譜法的使用越來越少。

酶聯免疫吸附法（ELISA）

 酶聯免疫吸附方法是以抗原抗體的特異性結合酶與底物顯色反應為基礎的檢測方法。酶聯免疫吸附法具有靈敏度高、干擾小、簡便、快速、操作安全、特異性強、檢測成本低等特點。該方法是篩選方法，2~3小時完成檢測，需要借助酶標儀判讀結果。

膠體金方法

 膠體金技術又稱側流向免疫層析技術，是以膠體金作為示蹤標記物應用于樣品中待測物檢測的一種免疫檢測技術，可用于樣品中待測物質的快速定性或定量檢測，是一種穩定、靈敏的檢測方法。該方法操作簡單，無需專業培訓，幾分鐘即可完成檢測，非常適用于現場快速檢測。目前，市場上的膠體金檢測條大部分為定性檢測條，無法進行定量檢測。

 美國Charm公司的Charm Rosa真菌毒素定量檢測系統采用膠體金免疫層析原理，能夠在5分鐘內快速定量測定糧食及其制品中的真菌毒素，包括黃曲霉毒素、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、伏馬菌素和T2/HT2毒素。該系統由檢測條、孵育器和讀數儀組成，其中檢測條采用3線設計，包括2條檢測線（T線）和1條質控線（C線），便于準確定量，增加動態檢測范圍；另外，檢測條封閉包裝，可防止檢測條因暴露在空氣中而被污染。孵育器為保溫裝置，能夠促進樣品流動并確保反應溫度，該孵育器可自動，孵育結束后發出“嗶嗶”聲。讀數儀主要用于讀取定量檢測結果，檢測結果可儲存于儀器內，也可傳輸至電腦或打印機。

系統特點

5分鐘快速定量檢測；

擁有業內最齊全、最完整的霉菌毒素檢測項目；

樣品制備過程簡單快速；

無需使用霉菌毒素標準品，對檢測人員無毒無害；

檢測結果與國標方法具有較高的一致性；

廣泛適用于實驗室、糧倉、農產品收購站等各種場合；

 產品通過USDA-GIPSA（美國農業部-美國谷物檢驗、批發及畜牧場管理局）和FGIS（聯邦谷物檢測局）認證；

該方法為中國糧食局糧油檢測行業標準。

 高效液相色譜法（HPLC）、液質聯用法（LC-MS）、免疫親和層析凈化熒光光度法等方法為標準規定的檢測方法，結果準確，靈敏度高，但是對操作人員的技術要求較高，操作較為復雜，均需在實驗室進行，且成本較高，無法適應現場快速檢測的需要。新《食品安全法》明確規定，食品藥品監督管理部門可以采用規定的快速檢測方法對食用農產品進行抽查檢測，可見對快速檢測方法的認可。準確、簡單、高效、低成本的現場快速檢測方法是真菌毒素檢測的發展趨勢。