食品中真菌毒素快速檢測方法

□ 北京維德維康生物技術有限公司 供稿

 北京維德維康生物技術有限公司（以下簡稱“維德維康”）是一家專注于中有害化合物（農獸藥、微生物、重金屬、非法添加物等）殘留快速檢測技術、動物疫病快速診斷技術研究及相關產品開發的中關村高新技術企業、高新技術企業、火炬計劃重點高新技術企業和北京市專利示范單位。維德維康作為中國農業大學、獸藥安全評價中心的產業化基地，與中國獸醫藥品監察所、食品安全風險評估中心等權威機構共建合作平臺，結合自身雄厚的科研力量，形成了一系列具有自主知識產權的關鍵技術、重點產品和創新工藝，擁有食品安全檢測抗原抗體資源近千種，供應檢測試劑及設備千余種。

真菌毒素的危害

 真菌毒素是由產毒真菌在適宜環境條件下產生有毒代謝的產物，廣泛存在于糧油食品和飼料中，是自然發生的最危險的食品污染物之一。據聯合國糧農組織估算，全球每年約有25%的農產品受到真菌毒素的污染，每年糧食及食品損失達到10億噸。在我國，真菌毒素的污染狀況同樣不容樂觀。根據糧食局不完全統計，每年真菌毒素污染造成的糧食損失累計約3100萬噸，占糧食總產量的6.2%,相當于陜西、甘肅、青海、寧夏、西藏5個省（自治區）全年糧食產量的總和。而糧油產品真菌毒素污染導致的應急搶救和醫療、善后撫恤、畜禽因病死亡、病畜銷毀處理等間接損失更大。可以說，我國農產品中真菌毒素污染嚴重，已成為農業可持續發展的重要限制因素之一，嚴重威脅著人類與動物的健康。

 現已查明自然界存在的真菌毒素有200多種，按真菌毒素的重要性及危害依次排列為：黃曲霉毒素、赭曲霉毒素A、單端孢霉烯族毒素、玉米赤霉烯酮。真菌毒素具有兩種毒性，一是致DNA損傷，嚴重者可致癌；二是細胞毒性，有破壞質膜和細胞酶的作用。

 對整個食品產業鏈而言，真菌毒素是一種“看不見的威脅”,能引起急、慢性中毒，損害肝臟、腎臟、神經組織、造血組織等，嚴重的可導致死亡。真菌毒素中的黃曲霉毒素和鐮刀菌素被聯合國糧農組織（FAO）和世界衛生組織（WHO）列為自然發生的最危險的食品污染物，具有強毒性和致癌性。黃曲霉毒素更被列為I級致癌物，是惡性腫瘤的主要誘因之一；鐮刀菌素中，以T-2毒素的毒性最強。

殘留限量

 目前，世界上有100多個或地區已經制定了食品和飼料中真菌毒素的限量標準與法規，近幾年歐盟等發達和地區逐漸提高了真菌毒素的限量標準。我國各級政府十分重視真菌毒素的防控工作，農業部、科技部相繼立項相關研究和污染調查，并分別在2005年和2011年發布和修訂了真菌毒素的限量標準，在一定程度上減少了真菌毒素對人類健康的危害。幾種常見霉菌毒素的殘留限量如表1.

主要檢測方法

 食品中真菌毒素含量的檢測方法一直是制約真菌毒素與人類疾病研究進展的關鍵，現有的真菌毒素典型檢測方法包括：高效液相色譜法、薄層色譜法、毛細管電泳法、液質聯用法等。隨著科技的進步，也衍生出了其他各種檢測方法，如光化學衍生-高壓液相色譜法、電化學衍生-高壓液相色譜法、熒光光度法、液相色譜-三重串聯四極桿質譜法等。這些方法所用到的設備價格昂貴，樣品要經過復雜的前處理，要求技術人員有較強的操作能力和分析能力；另外儀器的耗材和維護費用都很高，導致每個樣品的檢測成本一般在200元以上，且儀器方法需對樣本進行依次檢測，而平均每個樣本的檢測時間均在兩個小時以上，甚至需要1天的時間。新方法雖然具有靈敏、的優點，但普遍存在著成本昂貴、操作繁瑣、人員要求高、耗費時長等問題，限制了其推廣和應用，不利于常規檢測，目前主要作為檢測的參考依據使用。因此，建立準確、高效、快速檢測真菌毒素的方法是目前亟待解決的關鍵問題。

 免疫化學分析方法，是利用抗原和抗體的特異性反應為基礎建立起來的特異性高、靈敏度高、成本低、對操作人員要求低的一類快速分析方法，其對環境和儀器要求低，樣品檢測通量高、速度快，因此適合大量樣品的快速篩查和現場檢測。常見的免疫化學分析方法可以分為酶聯免疫吸附分析（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA）、免疫層析試紙條（immunochromatographic strip,ICA,也稱Lateral-flow colloidal gold-based immunoassay,俗稱膠體金試紙條）、免疫親和柱（Immunoaffinity chromatography,IAC）、化學發光免疫分析（chemiluminescent enzyme-linked immunosorbent assay, CL-ELISA）以及時間分辨熒光免疫分析（timed-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA）等。其中最常用、最成熟、應用最廣的主要是ELISA和膠體金試紙條。ELISA 除了肉眼定性判斷和半定量判斷結果，還可通過酶標儀測定吸光值進行定量分析；膠體金試紙條只需將試紙條插入待測液體，即可在幾分鐘內讀取結果，是最適合現場檢測的免疫分析方法。

維德維康真菌毒素檢測解決方案

以黃曲霉毒素M1為例介紹維德維康食品中真菌毒素解決方案：

黃曲霉毒素M1酶聯免疫試劑盒

 將抗原固定到酶標板上，并保持其免疫活性。抗體與酶連接成酶標抗體，這種酶標抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。測定時，把受檢標本和酶標抗體按不同的步驟與酶標板表面的抗原反應。用洗滌的方法使酶標板上形成的抗原-抗體復合物與其他物質分開，結合在酶標板上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應底物后，底物被酶催化變為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，根據顏色反應的深淺來判斷樣品中黃曲霉毒素M1的含量。含量少，顯色深；含量多，則顯色淺。

 設備：酶標儀（檢測波長450nm,參考波長630nm）；漩渦振蕩器；微量移液器；計時器；離心機（4000g）。

檢測步驟：

a.將樣品用去離子水稀釋；

b.將標準品工作液加入對應的標準品板孔中；

c.在樣品孔中依次加入樣品和酶標記物工作液；

d.蓋好蓋板膜，輕輕振蕩，室溫下避光反應；

e.倒掉板孔中液體，在每孔加入洗滌工作液，充分洗滌4次；

f.倒掉板孔中液體，將酶標板倒置于。