上轉發光技術及其在食品中病原微生物檢測的應用

□ 林長青 北京熱景生物技術有限公司

 近年來，由食源性致病菌引發的食物中毒不斷發生，1996年日本發生了世界上規模的歷時3個月、波及40多個都府縣、涉及上萬人的大腸桿菌O157食物中毒事件；2001年因發生“瘋牛病”導致德國衛生部部長和農業部部長辭職；2005年遍及整個東南亞的禽流感更為各國的安全部門敲響警鐘；2011美國23個州爆發了活禽引發的沙門氏菌疫情，造成將近100人感染；我國也爆發過多起由食源性致病菌引起的食物中毒事件，其中1999年爆發的大腸桿菌O157:H7中毒事件，中毒人數達2萬，其中死亡177人，給我國經濟造成了巨大損失。

 食品安全已成為世界各國共同面臨和關注的問題，由病原微生物引起的食源性疾病是影響食品安全最主要的因素之一。快速而準確地檢測出被稱為“頭號殺手”的食品致病菌，是確保食品安全的首要任務，因此建立一種快速、準確、便捷的檢測技術，對于從源頭制止食源性致病菌污染，預防中毒事件的發生具有重要意義。食源性致病菌的傳統檢測方法主要有微生物培養法、電阻電導測定法、細菌直接計數法、分子生物學法、免疫學方法等。但傳統微生物檢驗方法，不僅步驟復雜，而且耗時費力、靈敏度也不高，難以吸水紙上，拍干；

g.立即在每孔中加入底物混合液，蓋好蓋板膜，輕輕振蕩混勻，室溫下避光反應；

h.揭開蓋板膜，在每孔中加入終止液，輕輕振蕩混勻；

i.終止后5min內用酶標儀取吸光度值。

 該試劑盒靈敏度0.04ppb,原奶樣本檢測限為0.1ppb,奶粉檢測限為0.5ppb,樣品回收率范圍90%±30%.

黃曲霉毒素M1快速檢測試紙條

 試紙條將特異性的抗原以條帶狀固定在膜上，金標抗體吸附在微孔中，待檢樣本溶解微孔的金標抗體后通過毛細作用向前移動至固定抗原區域時，待檢物與金標抗體的結合物又與之發生特異性結合而被截留，聚集在檢測帶上，可通過肉眼觀察到顯色結果。

設備：溫育器；微量移液器。

檢測步驟：

a.將待檢奶樣和產品組分恢復至室溫；

b.打開鋁箔袋，取所需量金標微孔和試紙條；

c.待檢奶樣充分搖勻后加入金標微孔中，置于50℃溫育器中溫育；

d.將試紙條插入金標微孔中反應；

e.從金標微孔中取出試紙條，去試紙條下端的樣品墊，判定結果。

結果判定：

陰性：T線比C線顏色深或者一致，檢測結果為陰性。

陽性：T線比C線顏色淺或者沒有顏色，檢測結果為陽性。

無效：C線不顯色，無論T線是否顯色，該試紙條均判為無效。

該試紙條對原奶和奶粉檢測限均為0.2ppb.

 黃曲霉毒素M1膠體金檢測試紙條具有靈敏度高、特異性強、快速、簡便、經濟、穩定性好等優點。可以滿足大量試樣篩選的需要，可以在小型和現場實驗室進行，在商檢、衛檢等基層容易普及。

 適應飛速發展的現代食品生產要求。上轉發光技術是一種新的檢測方法，具有簡便、快速、廉價、適應性廣等優點，可用于基層單位中各種食源致病菌的快速篩查檢測。

食品中病原微生物快速檢測

技術常用方法及其優缺點

 食品微生物快速檢驗方法的研究始于上世紀80年代早期，隨著食源性疾病發病人數顯著增加，即使在發達，食源性疾病也呈上升趨勢，各國也越來越重視此項工作。近年來，人們采用免疫學、生物化學和分子生物學等先進技術進行快速檢驗方法的研究，使其發展更為迅速。傳統的食源性病原微生物的檢測、鑒定仍停留在分離培養、形態觀察、生化鑒定和血清學分型等水平，存在操作煩瑣、檢測周期較長、檢測結果往往存在不同程度滯后等缺點，這不僅不利于食品安全管理體系及時驗證控制措施實施效果，也不利于對潛在不安全產品迅速采取糾正措施。對食源性致病菌進行準確、靈敏、省時、省力和省成本的快速檢驗方法已經成為保證食品安全的迫切需求，從長遠發展趨勢來說，快速方法是微生物檢測的一大方向。上世紀50年代以來，國內外學者進行了大量的研究，從以傳統方法為基礎發展到以免疫學（如ELISA及免疫層析試紙條法）為基礎或以分子生物學法（如常規PCR及熒光定量PCR方法）為基礎的快速檢驗方法，并在實踐檢驗中不斷取得新進展。ATP法、免疫法、和顯色培養基法在國外應用相當成功，國內的許多檢測機構也在使用或正在考慮使用國外先進的快速檢測技術，如紙片法、生物化學技術（如PCR技術和基因探針技術等）、選擇鑒定用培養基法、免疫學技術、細菌直接計數法、全自動微生物分析系統（AMS）等。但這些方法中有些要求配備特殊的儀器，有些需要操作人員具有較高的技術水平，還有些財政和人力投入較大，因此絕大部分微生物快檢方法在基層單位暫時無法推廣應用。目前應用于微生物檢測的常用方法及其優缺點見表1 .

上轉發光技術

 上轉發光技術（up-converting phosphor technology,UPT）是基于上轉發光材料（up-converting phosphor,UCP）而發展起來的一種新型標記技術，UCP是由幾種稀土金屬元素摻雜于某些晶體的晶格中構成的納米級顆粒。由于獨特的結構，UCP可由紅外光激發而發射可見光--上轉發光（up-converting）。這種絕無僅有的性質使UCP作為標記物在生物分析中，以無本底干擾、無焠滅、適于多重分析和定量分析等具有顯著優勢，從本質上有別于傳統標記物。因此一種叫做上轉換發光顆粒免疫層析（UPT-LF）的檢測技術應運而生，因其具有對樣品種類的耐受程度高，不受操作環境、技術人員及設備的限制，操作過程簡單快速的同時能夠得到多重定量結果等諸多優點逐漸發展起來。

上轉發光技術檢測原理

 UCP包括3種主要成分：主基質、吸收子和發射子，由于其獨特的結構，可以出現反Stokes現象，即這種材料可在紅外光區（波長>780nm）被激發，卻發射波長遠短于激發光的可見光（波長為475~670nm），這一現象在自然界中并不存在，其基本原理是雙光子或多光子熒光，即能量上轉。選擇不同的吸收子、發射子和主基質可使UCP具有不同的光學性質，成為其使用靈活的基礎。

 上轉發光技術與經典的免疫層析技術相結合，采用新型標記物--UCP上轉發光材料，通過掃描分析光電信號，實現對目標抗原或抗體的現場快速檢測。上轉發光技術試紙條是由UPT與免疫層析共同組成，主要由試紙條以下5個部分組成：樣品墊、結合墊又稱結合物稀釋墊、分析膜、吸水墊、粘性底襯。疊合順序如圖1所示，通過粘膠固定于粘性底襯上。

 各部分的作用分別為：樣品墊是滴加被檢樣品的部位；結合墊中含有標記物-生物活性分子結合物，在加入被檢樣品后，其可在試紙條上發生免疫反應；分析膜是免疫反應發生的部位，因此是層析試紙的核心結構，抗原、抗體等生物活性分子均固定其上作為檢測帶和質控帶；吸水墊的虹吸作用為整個反應過程中的液流提供動力。為保證液體在試紙條上流動的連續性，各個部分之間需要有一定的重疊區。

 檢測時，首先將待檢樣品滴加到樣品墊上，樣品通過滲透與虹吸作用進入結合墊，使其中固定的標記物--生物活性分子結合物重新解離，并在吸水墊的虹吸作用下，離開結合墊流入分析膜，向吸水墊的方向流動。此過程中標記物--生物活性分子結合物、目標被檢物與檢測帶、質控帶之間將發生一定的特異性免疫反應，并通過具有指示性的標記物產生反應信號。依據所發生的免疫反應方式的不同，可分為夾心模式與競爭模式。

上轉發光技術發展的歷程

 UCP作為生物標記物所具有的獨特優勢在1995年便已引起了美國軍方的重視，在國防部下屬DARPA（Defense Advanced Research Projects Agency）的大力支持之下，開發了基于上轉換發光技術的手持式傳感器以及流式細胞儀（如圖2），用于對戰場上可能使用的多種生物戰劑進行快速的預警與鑒定。

 國內得益于我國稀土資源豐富，研究單位包括軍事醫學科學院微生物流行病研究所楊瑞馥實驗室、北京熱景生物技術公司，在2000年已經完成了UCP顆粒的制備，而且在顆粒上有了一定的突破；2002年創造了以UCP為基礎的自主研制PCT;2003年，研制出了代UPT免疫分析儀；2005年研制出了第三代便攜式系統，應用于安全、部隊、疾控生物戰劑檢測，在生物應急領域，研制完成的UPT快速檢測系統（UPT生物傳感器及UPT免疫層析試紙）可檢測鼠疫菌、炭疽芽孢、布魯氏菌、抗鼠疫菌抗體、抗SARS-CoV抗體、霍亂O1菌、霍亂O139菌等多種病原體，已推廣多個地方疾控系統--北京市衛生局、中國檢驗檢疫科學研究院、防化研究院、鼠疫防治系統等職能單位；2008年，UPT系統已經實現了產業化；2011年獲得國內個自主知識產權現場檢測技術生產文號，并獲得了完整的工藝流程與系統產品，已經開發出了面向臨床、生物反恐、食品安全快速檢測儀器及試劑，總共獲得12個產品批準文號，該系列產品打破了國外技術的壟斷，項目產品已經用于臨床檢測、軍隊和地方生物反恐、食源性致病菌檢測等；2014年該項目獲得中華醫學會二等獎、北京市科技進步二等獎。

上轉發光技術在微生物領域的應用

 UCP獨有的上轉發光現象決定了它不存在背景干擾，Niedbala等（2001）報道了上轉磷光技術已被應用于免疫標記分析，UCP作為標記物的免疫層析技術，它不僅克服了膠體金免疫層析只能定性而不能定量的缺陷，更以其適用于多重分析、無背景吸收、無焠滅等特點，賦予了免疫層析技術新的特性。2001年有學者報道，用上轉換熒光橫向流檢測特定核酸氨基酸序列是一種快速，靈敏的檢測DNA方法，可以識別人類乳頭狀瘤病毒16種類型的感染。Zuiderwijk M等（2003）報道了用雙抗體夾心免疫層析法，在上轉換熒光免疫技術和橫向流動技術的基礎上，可檢測病原體鏈球菌，檢測結果顯示，只需要1ng DNA即可檢測出肺炎鏈球菌，表明了UPT技術在傳染病領域的應用潛力。Zhongqiang Y,Lei Z等在2006年研究開發了基于側向流免疫上轉換UPT技術的生物傳感器，這種生物傳感器已經被開發并用于快速定量檢測鼠疫耶爾森氏菌，研究原理是用納米級的UCP顆粒作為標記物，采用夾心免疫層析法，在UPT--LF免疫分析系統的平臺上進行檢測，從樣品處理到數據結果分析不到30分鐘。Vijaya等（2007），應用上轉發光法快速檢測呼吸道合胞病毒感染，此檢測設備運用新型上轉磷光技術，也是上轉磷光技術次用于傳染性疾病的檢測，此設備設計便攜，

 可以直觀的判定呼吸道合胞病毒（RSV）感染檢測，此種方法的臨床檢測靈敏度為90%,特異性為98.3%,與經過RT-PCR驗證的病毒培養相比較，相關系數達到96.2%.Corstjens等（2008），用UCP作為標記的層析流技術檢測T細胞分泌的γ-干擾素，其分析靈敏度>2pg/mL.

上轉發光技術在食品中病原微生物檢測的應用

 據WHO估計，由于全球性食品貿易的快速增長以及人口的流動，飲食習慣的改變，新食源性致病菌不斷出現，全世界每年發生食源性疾病數10億人，每年約有200萬兒童死于腹瀉，其中66%以上是由細菌性致病菌所致。

 食源性致病菌導致的疾病是食品安全的關鍵問題，其中動物源性食品中沙門氏菌、大腸桿菌O157、霍亂弧菌、副溶血弧菌等引起的食源性疾病是食品安全的主要問題。UCP作為標記物的免疫層析技術，它不僅克服了膠體金免疫層析只能定性而不能定量的缺陷，更以它適用于多重分析、無背景吸收、無焠滅等特點，賦予了免疫層析技術新的特性。傳統的橫向流方法通常用有色顆粒標記，像膠體金或著色，通過顏色識別結果，然而，定性以及較低的靈敏度限制了其檢測應用，而UCP顆粒在檢測線下仍然可以檢測，用基于橫向流的上轉發光技術分析，可以在109CFU/mL的微生物環境下檢測到103CFU/mL的大腸桿菌O157:H7,濃度變異系數在0~107organism/mL之間均<10%,對于較小的微生物，檢測線在5ng/mL以下。而且，此技術可以進行多重檢測，可同時進行多靶標檢測。研究發現，使用上轉發光免疫層析試紙盒可對包括乙型副傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌O1、O139群、大腸桿菌O157、甲型副傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、副溶血弧菌、傷寒沙門氏菌和丙型副傷寒沙門氏菌在內的10種食源性致病菌進行檢測，不增菌檢測敏感性為109~105CFU/mL,增菌敏感性<10CFU/mL.均可滿足食物樣本增菌檢測和腹瀉樣本直接檢測的靈敏度需求。線性擬合系數R2介于0.9~0.98之間，均具有良好的定量能力。每種試紙與其它9種菌之間無明顯交叉反應，特異性良好。

上轉發光技術在食品中病原微生物檢測的應用前景

 李斯特氏菌、沙門氏菌和大腸桿菌等食品致病菌，已經成為威脅食品安全的頭號殺手，快速而準確檢測出被稱為“頭號殺手”的食品致病菌，是確保食品安全的首要任務，UCP作為標記物的免疫層析技術，它不僅克服了膠體金免疫層析只能定性而不能定量的缺陷，更以它適用于多重分析、無背景吸收、無焠滅等特點，確保了在檢測過程中高度的敏感性、穩定性、安全性，賦予了免疫層析技術新的特性。同時上轉發光技術的UCP顆粒因其具有對樣品種類的耐受程度高，不受操作環境、技術人員及設備的限制，操作過程簡單快速的同時能夠得到多重定量結果等諸多優點逐漸發展起來，可以廣泛應用于國內基層單位對食源性致病菌現場快速檢測及診斷。隨著對UCP研究的不斷深入，上轉發光技術在食品中病原微生物檢測的經濟價值、產業需求以及發展前景將不可限量。