液相色譜串聯質譜法測定奶粉中7種頭孢菌素殘留量

□ 王曉燕 諾安實力可（寧波公司）

摘 要：本文建立了奶粉中頭孢氨芐、頭孢匹林、頭孢唑啉、頭孢噻呋、頭孢喹肟、頭孢匹羅、頭孢洛寧殘留量檢測的HLB固相萃取凈化-超高效液相色譜-串聯質譜方法。奶粉經乙腈-水提取，正己烷除脂，經HLB固相柱凈化后供超高效液相色譜串聯質譜儀檢測。奶粉中頭孢氨芐、頭孢匹林、頭孢唑啉、頭孢噻呋、頭孢洛寧的檢出限為10μg/kg,定量限為20μg/kg,頭孢喹肟，頭孢匹羅的檢出限為20μg/kg,定量限為40μg/kg.采用基質匹配法對以上7種頭孢菌素奶粉添加樣品進行定量，在添加濃度水平為20μg/kg~200μg/kg范圍內，頭孢氨芐、頭孢匹林、頭孢唑啉、頭孢噻呋、頭孢洛寧的回收率為62%~90%,RSD為3%~11%.在添加濃度水平40μg/kg~200μg/kg范圍內，頭孢喹肟，頭孢匹羅的回收率為67%~85%,RSD為5%~10%.該方法準確度和精密度性能良好，適用于奶粉中上述7種頭孢菌素的多殘留檢測。

關鍵詞：奶粉 頭孢氨芐 頭孢匹林 頭孢唑啉 殘留

 頭孢菌素是由冠頭孢菌培養液中分離出的頭孢菌素C,經半合成制得的一類β-內酰胺類抗生素。該類抗生素的抗菌作用機制為其可抑制細菌細胞壁黏肽合成酶，影響細菌細胞壁黏肽合成，使細菌細胞壁缺損，水分由外環境不斷進入高滲的菌體內，導致菌體在無細胞壁約束的情況下不斷膨脹裂解死亡[1].頭孢菌素抗生素品種繁多且不斷更新，典型的有頭孢氨芐、頭孢匹林、 頭孢唑啉、頭孢噻呋、頭孢喹肟、頭孢匹羅、頭孢洛寧、頭孢拉定、頭孢呋辛、頭孢曲松、頭孢哌酮等。

 頭孢菌素抗生素目前主要用于治療革蘭氏菌如葡萄球菌、肺炎球菌、鏈球菌、大腸桿菌、嗜血桿菌、沙門氏菌等引起的各種感染[2].在畜牧業中常用來控制奶牛乳房炎[3~5],治療動物尿道、胃腸道和呼吸道等感染。在防止動物疾病的過程中，由于人為使用方法不當或不遵守休藥期規定等原因，易造成頭孢菌素抗生素在動物產品中的殘留，然后通過食物鏈的傳遞富集，給人類健康帶來嚴重危害，主要體現在對人體腎臟和肝臟功能的損害[6],產生過敏反應可致皮疹、蕁麻疹、哮喘、藥熱、血清病樣反應、血管神經性水腫、過敏性休克等，導致胃腸道反應和胃腸道菌群失調，細菌耐藥性等[7].為此，歐盟、中國、美國、日本等已對動物源食品中頭孢菌素抗生素殘留量做出了殘留限量值的規定，牛奶中的限量要求一般為0.01~0.1mg/kg之間，最嚴格的頭孢洛寧為0.01mg/kg.

 目前，頭孢菌素殘留的常規檢測方法有微生物法、熒光法、液相色譜-紫外法、液相色譜-質譜法等，多為單項檢測或少數幾種頭孢菌素的多殘留檢測。本文針對頭孢氨芐、頭孢匹林、頭孢唑啉、頭孢噻呋、頭孢喹肟、頭孢匹羅、頭孢洛寧7種頭孢菌素類抗生素建立了一種專屬性強、靈敏度高和分析時間短的超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）方法，以保障對動物源性食品中該類藥物殘留的確證檢測。

1 材料和方法

1.1 儀器設備

 Waters Xevo TQD;分析天平（感量0.00001g）；天平（感量0.01g）；高速冷凍離心機；渦旋混合器；水平振蕩器；固相萃取裝置；Waters HLB固相萃取柱（500mg/6mL）；氮吹儀；濾膜（0.22μm）。

1.2 試劑和標準品

 乙腈、甲醇、正己烷均為HPLC級； 磷酸氫二鉀、氫氧化鉀、氯化鈉均為分析純；頭孢喹肟、頭孢唑啉、頭孢匹林、頭孢氨芐、頭孢洛寧、頭孢噻呋、頭孢匹羅，純度均>98%.

 0.05mol/L磷酸鹽緩沖溶液（PH=8.5）：稱取8.7g磷酸氫二鉀，超純水溶解，稀釋至1000mL,調PH至8.5±0.1.

 標準儲備液（1000mg/L）：準確稱取適量的頭孢氨芐、頭孢匹林、頭孢唑啉、頭孢噻呋、頭孢喹胿、頭孢匹羅、頭孢洛寧，用乙腈-水溶液溶解稀釋，分別配制成1000mg/L的標準儲備液，-10℃下保存，有效期為1年。

 混合標準工作液（5mg/L）：分別準確吸取適量的標準儲備液，用乙腈-水溶液配置成5mg/L的標準工作液，4℃下保存，有效期為1周。

1.3.樣品的提取與凈化

1.3.1提取

 稱取0.5g奶粉試樣（到0.01g）置于50mL離心管中，加入4.0mL水，使奶粉充分溶解，加入25mL乙腈+水（15+2），用均質器均質1min,于10℃、9500r/min條件下離心10min,取出上清液。

1.3.2凈化

 準確移取20.0mL提取液至離心管中，加入10mL乙腈飽和正己烷振蕩1min,靜置，棄掉正己烷，于40℃條件下氮吹至近干。用10mL磷酸鹽緩沖溶液溶解殘渣，渦旋混勻，用0.1moL/L氫氧化鈉溶液調節pH至8.5,然后以1mL/min的流速上樣HLB柱。先用2mL磷酸鹽緩沖溶液淋洗2次，再用1mL純水淋洗，棄去全部流出液。用3mL乙腈洗脫，收集洗脫液于15mL玻璃試管中，于40℃條件下氮吹近干，用純水定容至2mL,混勻后，過0.22μm濾膜，供超高效液相色譜串聯質譜儀定。

1.3.3 測定

 液相色譜條件：色譜柱：Waters AQ BEH C181.7μm,2.1mmx100mm;流動相：A:0.1%乙酸水溶液 B:乙腈；流速：0.2 mL/min;柱溫：30℃；進樣量：5μL.

 質譜條件：電噴霧離子源；正離子掃描；多反應選擇離子檢（MRM）；毛細管電壓為3kV;霧化氣溫度500℃；去溶劑氣流速800L/hr.

2. 結果與討論

2.1.提取和凈化過程對回收率的影響

 奶粉中含有脂肪、蛋白質、乳糖、無機離子等成分，理想的提取和凈化過程不僅可以有效去除干擾物質，得到可靠的定性結果，同時又不會對目標分析物造成過多的損失，得到準確的定量結果。本試驗分別考察了乙腈+水（15+2）提取過程，乙腈飽和正己烷去脂過程和HLB-SPE固相萃取凈化過程對奶粉中7種頭孢分析物回收率結果的影響，見表2.1.

 結果發現：乙腈飽和正己烷凈化過程和HLB-SPE固相萃取凈化過程對奶粉中7種頭孢類分析物的回收率均達85%以上，僅乙腈+水（15+2）提取過程對頭孢氨芐的提取效果較差，回收率不足60%,說明該試劑對頭孢氨芐的提取效率較低。因此，需要對頭孢氨芐的提取試劑進行優化。

2.2.濃縮方式的選擇

 有機試劑提取后需要對20mL樣品提取液進行濃縮至近干。為了提高濃縮效率，同時降低濃縮過程對7種頭孢分析物的影響，本試驗分別考察了旋蒸，氮吹，旋蒸后氮吹3種方式的濃縮效果，見表2.2.

 結果發現，40℃條件進行旋蒸濃縮，頭孢氨芐損失明顯，回收率不足30%,頭孢洛寧的回收率也不足80%;40℃條件下進行氮吹濃縮，7種頭孢菌類分析物的回收率在70%~110之間；40℃條件下先旋蒸，再氮吹至近干，7種頭孢類分析物的回收率在80%~之間。因此，綜合考慮工作效率和回收率結果，本實驗選擇40℃條件下氮吹至近干的濃縮方式。

2.3.方法驗證參數

2.3.1 線性

 用奶粉空白基質溶液分別配制濃度水平為2,5,10,20,50,100μg/L的頭孢菌素標準工作校正曲線，驗證該方法的線性范圍。如表2.3所示，在2~100μg/L濃度范圍內7個頭孢菌素基質匹配校正曲線的相關系數R2均大于0.99.

2.3.2 靈敏度

 按1.3節方法處理奶粉樣品，以S/N≥3確定檢出限（LOD），以S/N≥10確定定量限（LOQ）。如表2.3所示，頭孢氨芐、頭孢匹林、頭孢唑啉、頭孢噻呋、頭孢洛寧在奶粉中的檢出限（LOD）為10μg/kg,定量限（LOQ）為20μg/kg,頭孢喹肟、頭孢匹羅在奶粉中的檢出限（LOD）為20μg/kg,定量限（LOQ）為40μg/kg.

2.3.3 回收率和精密度

 用奶粉空白樣品分別制備濃度水平為20μg/kg,40μg/kg,80μg/kg,200μg/kg的添加樣品，每個水平制備3個平行樣品，用基質匹配校正曲線計算添加目標物的回收率和相對標準偏差。如表2.3所示，在20~200μg/kg濃度范圍內，頭孢氨芐、頭孢匹林、頭孢唑啉、頭孢噻呋、頭孢洛寧的回收率為62%~90%,RSD為3%~11%,在該濃度范圍內可以準確定量。在40~200μg/kg濃度范圍內，頭孢喹肟，頭孢匹羅的回收率為67%~85%,RSD為5%~10%.

3. 結論

 本文建立了HLB固相萃取凈化-超高效液相色譜串聯質譜檢測奶粉中頭孢氨芐、頭孢匹林、頭孢唑啉、頭孢噻呋、 頭孢喹肟、頭孢匹羅、頭孢洛寧7種頭孢菌素殘留量的方法。本方法準確度和精密度良好，適用于奶粉中上述7種頭孢菌素殘留量的檢測。

參考文獻

[1] 劉世良。抗菌藥物作用機制的研究[J].中外醫療，2012（4）；35.

[2] 中國獸藥典委員會。中國獸藥典[M].北京：化學工業出版，2005.

 [3] Bryan MA,HeuerC,Emslie FR.New Zeal Vet J,2011.59（4）：166.

 [4] Shephard RWBurmanS,Marcun P.Aust Vet J,2004,82（10）：624.

 [5] McDougall S.New Zeal Vet J,2010,58（1） : 45.

[6] 白國濤，儲曉剛，潘國卿等。色譜。2009,27（4）：417.

 [7] 陳號，彭開松，朱良強等。動物源食品中內酰胺類藥物殘留分析方法的研究進展[J].中國獸藥雜志，2008,42（5）：42-45.