摘要：目的：利用隨機擴增多態性方法（RAPD）對西藏地區牦牛奶酪中 27 株乳酸菌基因型進行同源性分析。方法：利用 5 個隨機引物對 Mg 2+ 濃度、dNTP 用量、退火溫度、模版用量/引物用量（ng/pmol）四個條件做單因素梯度試驗，建立反應條件，篩選引物，然后對 27 株乳酸菌和 4 株乳酸菌標準菌株進行隨機擴增，用 NTsys2.10e 軟件對擴增條帶進行聚類和遺傳相似性系數分析，分析結果同 16S rRNA 測序得到的菌種鑒定結果進行對比。結果：31 株菌遺傳相似系數在 0.72-1.000 之間，當相似性系數在 0.82 時，菌株被分成了 8 組，菌株按照不同種屬聚類，聚類結果同 16S rRNA 測序結果基本一致，同時成功將Lactobacillus casei 和 Lactobacillus paracasei 兩個亞種區分開 .結論：RAPD 技術可以較好地應用于西藏地區牦牛奶酪中乳酸菌親緣性關系分析。

關鍵詞：西藏；牦牛奶酪；乳酸菌；隨機擴增多態性；聚類分析

 西藏牦牛素有“高原之舟”的美稱，是我國重要的畜種。在高原地區牦牛乳及其制品是當地居民的重要食品。目前對于牦牛乳及其成分的報道日漸增多，但是對于牦牛奶酪中乳酸菌的報道卻很少。乳酸菌作為奶酪發酵過程中的關鍵菌種，對其進行分類鑒定有著極其重要的意義。

 隨機擴增多態性（RAPD）技術最初是由美國科學家Williams [1] 和Welsh [2] 運用于基因多態性分析中。

 它應用短的隨機引物，通過 PCR 反應隨機擴增后產生特異性的 D N A 圖譜，具有多態性高、操作簡單，引物沒有嚴格限制，可以實現高通量測定等優點。擴增圖譜重現性不高也是 RAPD 面臨的一個問題，但是通過 PCR 反應程序和體系的優化，引物的篩選可以解決圖譜重現性這個問題 [3-4] .目前很多國外學者將 RAPD 技術應用于乳酸菌基因型的研究中，如乳酸球菌屬 （Lactococcus） [5] 、明串珠菌屬[6] （Leuconostoc）、乳桿菌屬 [7] （Lactobacillus）、腸球菌屬 [8] （Enterococcus），很好地區別開親緣性較近的菌種。但是國內只有很少文獻報道了 RAPD 在乳酸菌基因分型中的應用。如高大威 [9] 等利用 RAPD 技術對鮮牛奶、西紅柿和酸菜中分離出的乳酸菌進行聚類分析，確定了乳酸菌間親緣性關系。秦丹 [10] 利用RAPD 方法對四川臘肉和香腸在加工和貯藏過程中的乳酸菌進行分析， 并將結果與傳統微生物培養法進行比較，兩種方法得到的結果不完全相同。

 本研究通過篩選出隨機引物 M13,單因素實驗獲得較好的圖譜重現性后對 27 株分離純化后的乳酸菌和 4 株乳酸菌標準菌株進行 RAPD 擴增，用 NTsys 2.10e 軟件對擴增后圖譜進行聚類分析，將聚類結果與各個菌株產地進行歸類對比，同時與 16S rRNA 序列分析后的菌種鑒定結果結果進行對比，從而探討 RAPD 技術在天然乳酸菌菌種分類鑒定方面的應用價值。

1  材料與方法

1.1 菌種與試劑

1.1.1 供試菌株

 供試菌株分離自西藏牦牛奶酪，由西藏農牧學院提供（表 1）。標準菌株：Lactobacillus casei ATCC 393,Lactobacillus paracasei ATCC BAA-52,Lactobacillus plantarum ATCC 8014,Lactobacillusrhamnosus ATCC 7469 青島海博生物技術有限公司購買。

1.1.2 試劑

 Lambda DNA/Hind III Marker 北 京 鼎 國 生 物 科 技 有 限 公 司 ; Taq 酶 （ 5U/μL ） 、dNTPs（10mmol/L）、10×酶緩沖液、MgCl 2 （25mM） 寶生物工程（大連）有限公司；1kb DNA ladder、溶菌酶、EDTA Na 2 、Tris-base、Guanidine Thiocyanate、DEPC 加拿大 BBI;瓊脂糖 西班牙 Agarose;蛋白酶 K 美國 Sigma; Gelred 核酸染料 美國 BIOTIUM; 細菌基因組提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司。實驗引物，100bp DNA ladder 生工生物工程（上海）股份有限公司。MRS 培養基的配制參照參考文獻 [11] .

1.2 儀器和設備

 HB031 金屬恒溫加熱器 上海博彩生物技術有限公司；SIM-F140AY65 型制冰機 三洋國際貿易有限公司；1-15PK 小型臺式離心機 德國 sigma 實驗室離心機公司；Biospec-mini 型島津 DNA/RNA/蛋白質分析裝置，日本島津制作所；S1000 高性能 PCR 儀，164-5050 伯樂基礎電源電泳儀，SyngeneGeneGenius 凝膠成像系統， 美國 Syngene 有限公司； GL-88B 渦旋混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 乳酸菌 DNA 基因組提取

 用試劑盒提取乳酸菌基因組 DNA,提取 DNA 保存于-20℃冰箱中。測定提取 DNA 的 OD 260 ,

 OD 280 及 OD 260 /OD 280 數值，利用公式 c= OD 260 ×50（μg/mL） ×n（稀釋倍數） [12] 計算出 DNA 濃度，為后續單因素實驗提供數據。

1.3.2 乳酸菌 16S rRNA PCR

 采用細菌 16S rDNA 基因的通用引物 [13] :正向引物為 27f（5-AGA GTT TGA TCM TGG CTCAG-3‘） ,反向引物為 1492r（5- GGT TAC CTT GTT ACG ACT T -3’）對 27 株菌提取的 DNA 進行擴增，擴增產物用 2.0%瓊脂糖進行凝膠電泳。將擴增產物送上海生物工程有限公司測序。

1.3.3 16S rRNA 序列同源性分析

 登陸 NCBI（//www.ncbi.nlm.nih.gov）數據庫，用 Blast 軟件將 16S rRNA 測序結果與已知序列進行相似性分析 [11] ,同時對 27 個菌株的測序結果采用 UPGMA（Unweighted Pair Group Method withArithmetic Mean）法進行聚類分析，并構建各菌株的遺傳距離聚類圖。

1.3.3 RAPD 隨機引物的篩選及 PCR 反應體系和條件的優化

 隨機引物的篩選：通過對 5 條不同隨機擴增引物（表 2）進行 PCR 反應，根據條帶的多態性和亮度選擇出最適引物，進行后續單因素實驗。

 PCR 反應體系優化：預設 PCR 反應體系 [15] 為 5U/ μL Taq 酶 0.2μL,10 μmol/L 引物 0.5 μL,模版 DNA/引物用量=20,10×Taq 酶緩沖液（無 Mg 2+ ）2.5 μL,25mM MgCl 2 2.5 μL,2.5mmol/L dNTPs0.6 μL.

 Mg 2+  濃度優化：預設 PCR 反應體系中 Mg 2+  濃度分別設為 1.0;1.5;2.0;2.5;3.0mM,其余試劑濃度保持不變，選擇 Mg 2+  濃度。

 模版 DNA/引物用量比例優化： 預設 PCR 反應體系中模版 DNA/引物用量的比例分別設為 5; 10;20;40;80,其余試劑濃度保持不變，選擇模版 DNA/引物用量比例。

 dNTP 用量優化：預設 PCR 反應體系中 dNTP 用量分別設為 30;60;90;120;150μM;其余試劑濃度保持不變，選擇 dNTP 用量。

 PCR 反應條件優化：預設 PCR 反應程序 [15] 為 94℃預變性 3min,94℃變性 1:00min;50℃退火1:00min;72℃延伸 2:00min;35 個循環，然后 72℃延伸 10min.

 退火溫度的優化：預設 PCR 反應條件中退火溫度分別設為 46;47;48;49;50℃，其余條件保持不變，選擇退火溫度。

 PCR 擴增產物通過 1.0%瓊脂糖凝膠電泳（70V,1h） ,gelred 染色后凝膠成像。通過電泳條帶的數量，亮度，重復性和特異性條帶來確定反應條件。

1.3.3 RAPD 擴增產物檢測

 擴增產物經 1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離。取 10 μL 擴增產物與 2 μL loading buffer 混勻，點樣于凝膠孔，用 1kb DNA ladder 作為分子量標尺，電泳緩沖液為 1×TAE,70V 恒壓電泳 60min,gelred染色后通過凝膠呈像系統拍照。

1.3.4 RAPD 譜帶分析

 各菌株的擴增圖譜上特定位點無條帶的賦值為 0, 有條帶的賦值為 1, 用 NTsys2.10e 制作為 “0,1”文件，采用 UPGMA（Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean）法進行聚類分析，并構建各菌株的遺傳距離聚類圖。

 圖 1a 顯示 27 株菌的 DNA 提取結果， OD 260 /OD 280 的范圍在 1.8-2.2 之間， 在 23000bp 處有明顯的單一條帶。圖 1b 顯示 27 株菌 16S rRNA 的 PCR 擴增結果，在 1500bp 處有明顯的單一條帶。說明各菌株基因組 DNA 均被成功提取出，同時成功擴增出目標片段。

2.1.3 16S rRNA 序列同源性分析

 由圖 2 可知，27 株菌分為 6 個大的分支，其中 21-1、16-4、17-1、26-1、15-1、21-2、123-4、12-2、122-1、20-1、13-3、23-3、11-2、24-3、12-1、02-1、14-3、19-2 位于一個分支，屬于 Lactobacilluscasei 或者 Lactobacillus paracasei.125-2 處于一個分支，屬于 Lactobacillus parabuchneri.16-1、16-2、19-1 位于一個分支， 屬于 Lactobacillus diolivorans. 17-5、 28-1、 20-2 位于一個分支， 屬于 Lactobacillusplantarum.14-1 位于一個分支，屬于 Lactobacillus helveticus.123-2 位于一個分支，屬于 Leuconostocmesenteroides.圖中未能將 Lactobacillus casei 和 Lactobacillus paracasei 分開。

2.2 單因素反應電泳圖

2.2.1 退火溫度

 通過圖 3a 可以看出，退火溫度由 46℃升到 48℃過程中，條帶的亮度逐漸增加，溫度由 48℃升到 50℃的過程中，條帶的亮度和數量保持不變，同時條帶整體重現性較好，考慮到退火溫度較低時引物與模版結合更好，所以 PCR 反應中退火溫度選用 48℃。

2.2.2 模版 DNA/引物用量（ng/pmol）比

 由圖 3b 可以看出電泳條帶的整體重現性很好，在 5 倍和 10 倍的情況下出現 5 個條帶，同時考慮到在 10 倍情況下條帶亮度更佳，所以 25uL PCR 反應體系模版 DNA/引物用量的比例選用 10.

2.2.3 Mg 2+ 濃度

 由圖 3c 可以看出電泳條帶整體重現性很好，隨著 Mg 2+ 濃度的升高，條帶的亮度逐漸增加，在Mg 2+ 濃度為 3.0mM 是效果，所以 25μL PCR 反應體系中 Mg 2+ 的濃度選用 3.0mM.

2.2.4 dNTP 用量

 由圖 3d 可以看出隨著 dNTP 用量的增加條帶的亮度顯著增加，在 150uM 時達到最亮，同時條帶整體重現性較好，在 150μM 條件下達到了 7 條，所以 25μL PCR 反應體系中 dNTP 用量選用 150μM.

 經過單因素反應測試， 得到優化的 RAPD 擴增程序為： 94℃預變性 3min, 94℃變性 1:00min; 48℃退火 1:00min;72℃延伸 2:00min;35 個循環，然后 72℃延伸 10min.優化的 PCR 反應體系為：25μL總反應體積， 模版 DNA/引物用量=10,10×Taq 酶緩沖液（無 Mg 2+ ）2.5μL,25 mM MgCl 2 3.0μL,2.5mmol/L dNTPs 1.5μL,10μmol/L 引物 0.5μL,5U/μL Taq 酶 0.2μL,滅菌純水補至 25μL.對 4 株乳酸菌標準菌株和 27 株分離乳酸菌進行 RAPD 擴增。

2.3 整體乳酸菌 RAPD 圖譜

 27 株西藏牦牛奶酪分離乳酸菌和四株乳酸菌標準菌株用 M13 引物擴增并電泳后， 所有菌株均擴增出明顯的條帶，同時 16S rRNA 鑒定出相同屬的菌株之間可以看出明顯的相似性，各個菌株之間也存在特異性，擴增出的條帶數目在 3-10 條之間，所獲得的片段分子量大小在 250-3000 之間，圖 4 顯示了 31 株乳酸菌擴增后的電泳圖。

2.4 聚類分析

 用 NTsys2.10e 軟件，按照 UPMGA 法，對供試菌株之間的遺傳相似系數矩陣進行聚類分析，得到聚類分析圖 5.由圖 5 可知，當相似性系數為 0.82 時，分離自牦牛奶酪的 27 株乳酸菌和 4 株乳酸菌標準菌株被分成了 8 個組。組包括 11-2、122-1、12-2、21-1、23-3、21-2、24-3、15-1、13-3、02-1、 12-1、 19-2、 14-3、 17-1 和 casei 標準菌株， 它們都是 Lactobacillus casei. 第二組只有一支菌 123-2,為 Leuconostoc mesenteroides.第三組中 16-1、16-2、19-1、聚為分支，它們是 Lactobacillusdiolivorans.另一分支為 125-2,是 Lactobacillus parabuchneri,Lactobacillus rhamnosus 單獨成為一個分支。第四組只有一支菌 14-1,為 Lactobacillus helveticus.第五組中 paracasei 標準菌株單獨成為一分支，26-1 和 123-4 聚為另一分支，為 Lactobacillus paracasei.第六組只有一支菌 16-4,為 L.casei.

 第七組只有一支菌 20-1,為 L.casei.第八組包括 17-5、28-1,、20-2 和 plantarum 標準菌株，它們都是Lactobacillus plantarum.通過聚類分析圖和 16S rRNA 測序結果之間的相互比較可以發現 RAPD 聚類分析結果同16S rRNA測序結果基本一致， 但是16S rRNA 進化樹圖并不能夠將Lactobacillus paracasei和 Lactobacillus casei 兩個亞種區分開，而利用 RAPD 聚類分析結果可以將其區分開。由此可以得出在乳酸菌基因型分類鑒定中，RAPD 對于親緣型很近菌株的鑒定效果要優于 16S rRNA 同源性分析，更適合于西藏牦牛奶酪中乳酸菌親緣性關系分析。

3 討論

 西藏地區居民主要采用傳統手工方法制作奶酪，由于產地、乳酸菌種、制作工藝的不同，導致奶酪風味和質地的多樣化。乳酸菌又是奶酪制作過程中的核心，是奶酪品質好壞的關鍵。建立系統的鑒定方法對奶酪中乳酸菌進行分析，會對當地奶酪制品質量的提高起到很大的借鑒作用。

 目前對于細菌的鑒定主要有表型鑒定和基因型鑒定兩種方法。表型鑒定不僅在操作上具有一定的復雜性，同時在鑒定的水平上只能達到屬的水平，難以達到種水平的鑒定 [16] .而 RAPD 技術運用隨機引物對不同種群的基因組 DNA 進行擴增，不僅可以在分子水平上對菌株之間進行分類和鑒定，還可以整體基因組DNA進行多態性檢測， 同時操作簡易， 準確性高。 許多國外學者已經成功地將RAPD技術應用于乳酸菌的分離鑒定。如 Gevers [17] 等運用隨機引物（GTG） 5 成功地完成對干香腸中乳桿菌亞種的分類和鑒定。Corroler [18] 等運用 RAPD 技術對不同季節采集的牛奶中 L.lactis subsp.lacti 和 L.lactissubsp.cremoris 兩個亞種進行分類和鑒定。Cocconcelli [19] 等運用 RAPD 技術區分開嗜酸乳桿菌（L.acidophilus）、瑞士乳桿菌（L.helveticus）、干酪乳桿菌（L.casei） 、植物乳桿菌（L.plantarum）、糞腸球菌（Ent.faecalis）、屎腸球菌（Ent.faecium）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）等菌株。Nigatu [20] 等利用 RAPD 技術對 45 株乳桿菌進行區分， 所有菌株均擴增出了不同的多態性條帶， 并且相似度在 72%以上，對乳桿菌屬進行了最集中和廣泛的研究。

 本研究利用 16S rRNA 和 RAPD 技術對西藏牦牛奶酪中乳酸菌的基因型和遺傳多樣性進行了分析，用 NTsys 2.10e 軟件計算出了 31 株乳酸菌菌株之間的遺傳相似系數矩陣，并用 UPMGA 法作聚類分析圖，與 16S rRNA 序列分析結果相對比。在與 16S rRNA 序列分析結果的比較中，兩種基因型方法得出的結果基本是一致的。同時在 RAPD 的聚類圖中將 L.casei 和 L.paracasei 這兩個亞種有效的區分開來，這是 16S rRNA 技術在進行同源性分析時是做不到的，同時相關文獻中也無類似報道。綜合比較結果考慮，RAPD 技術在乳酸菌分類鑒定中有一定的應用價值，同時它有操作簡單快速、種間和種內區分效率高、費用低的優勢，與其他表型和基因型方法相結合，可提高菌種鑒定效率和準確性。

參考文獻

 [1] WILLIAMS J G K, KUBELIK A R, LIVAK K J, et al. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers [J]. Nucleic Acids Research, 1990,18（22）：6531-6535.

 [2] WELSH J, MCCLELLAND M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers [J]. Nucleic Acids Research, 1990,18（24）： 7213-7218.

 [3] TYLER KD, WANG G, TYLER SD, et al. Factors affecting reliability and reproducibility of amplification- based DNA fingerprinting of representative bacterial pathogens [J]. Journal of Clinical Microbiology, 1997, 35（2）： 339-346.

 [4] MICHELI MR, BOVA R, PASCALE E, et al. Reproducible DNA fingerprinting with the random amplified polymorphic DNA（RAPD） method [J]. Nucleic Acid Research, 1994, 22（10）： 1921-1922.

 [5] PSONI L, KOTZAMANIDIS C, YIANGOU M, et al. Genotypic and phenotypic diversity of lactococcus lactis isolates from Batzos, a Greek PDO raw goat milk cheese[J]. International Journal of Food Microbiology, 2007, 114（2）： 211-220.

 [6] TRIAS R, BADOSA E, MONTESINOS E, et al. Bioprotective Leuconostoc strains against Listeria monocytogenes in fresh fruits and vegetables[J]. International Journal of Food Microbiology, 2008, 127（1-2）： 91-98.

 [7] LPPEZ I, TORRES C, RUIZ-LARREA F. Genetic typification by pulsed-field gel electrophoresis （PFGE） and randomly amplified polymorphic DNA （RAPD） of wild Lactobacillus plantarum and Oenococcus oeni wine strains[J]. European Food Research and Technology, 2008, 227（2）： 547-555.

 [8] HOSSEINI S V, ARLINDO S, BOHME K, et al. Molecular and probiotic characterization of bacteriocin-producing Enterococcus faecium strains isolated from nonfermented animal foods[J]. Journal of Applied Microbiology, 2009, 107（4）： 1392-1403.

 [9] 高大威， 朱光華， 王立欣， 等。 三種食物中乳酸菌的親緣性關系及抗氧化活性研究[J]. 燕山大學學報， 2012, 36 （1） : 84-88.

 [10] 秦丹。四川臘肉和香腸加工貯藏過程中微生物系統的 RAPD 分析[D].四川：四川農業大學，2011:21-53.

 [11] 李平蘭，賀稚非。 食品微生物學實驗原理與技術[M]. 北京： 中國農業出版社， 2005: 264.

 [12] 林萬明。 細菌分子遺傳學分類鑒定法[M]. 上海： 上海科學技術出版社， 1990: 48-83.

 [13] AO X, ZHANG X, ZHANG X, et al. Identification of lactic acid bacteria in traditional fermented yak milk and evaluation of their application in fermented milk products [J]. Journal of Dairy Science, 2012, 95（3）： 1073-1084.

 [14] WARD L J H, TIMMINS M J. Differentiation of Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei and Lactobacillus rhamnosus by polymerase chain reaction [J]. Letters in Applied Microbiology, 1999, 29: 90-92.

 [15] 朱紅梅，廖萬清，戴建新，等。 用微小衛星引物 PCR 鑒定紅色毛癬菌和須癬毛癬菌[J]. 第二軍醫大學學報，2001,22（3）：252-254.

[16] 王庭柱。乳源球菌菌株的多相分類鑒定[D].哈爾濱：東北農業大學，2006.

 [17] GEVER D, HUYS G, SWINGS J. Applicability of rep-PCR fingerprinting for identification of Lactobacillus species[J]. Fems Microbiology Letters, 2001, 205（1）： 31-36.

 [18] CORROLER D, MANGIN I, DESMASURES N, et al. An ecological study of lactococci isolated from raw milk in the Camembert cheese Registered Designation of Origin area[J]. 1998, 64（12）： 4729-4735.

 [19] COCCONCELLI P S, PORRO D, GALANDINI S, et al. Development of RAPD protocol for typing of strains of lactic-acid bacteria and enterococci[J]. Letters in Applied Microbiology, 1995, 21（6）： 376-379.

 [20] NIGATU A, AHRNé S, MOLIN G. Randomly amplified polymorphic DNA （RAPD） profiles for the distinction of Lactobacillus species [J]. Antonie van Leeuwenhoek 2001, 79: 1-6.