5種鮮切蓮藕片脹袋微生物的分離與鑒定

 摘要：真空包裝鮮切藕片的脹袋問題影響了其產品質量，為了解決脹袋問題，研究了鮮切藕片脹袋主要微生物的種類，分離出 5 種優勢微生物，并利用 VITEK 2 Compact 全自動快速微生物鑒定智能分析系統進行鑒定。得到了 2 株細菌分別為陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae） 、蠟樣芽孢桿菌（Bacilllus cereus Frankland& Frankland） ,3 株酵母菌，季也蒙假絲酵母（Candida guilliermondii） 、無名假絲酵母（Candida famate）和葡萄牙假絲酵母（Candida iusitaniae） .

關鍵詞：脹袋藕片；分離；鑒定；VITEK 2 Compact 菌種鑒定系統

 蓮藕是我國栽培歷史悠久的水生蔬菜， 因其迷人的白色、 甜脆的口感和豐富的營養已經成為各地的蔬菜之一。近年來，鮮切蓮藕作為一種新型的微創處理蔬菜，以其方便、快捷、低碳、環保和安全潔凈的特點深受廣大顧客的喜愛 [1] .但是，鮮切蓮藕的保質期一直是制約產業化的瓶頸，究其原因，鮮切蓮藕在其加工過程中，細胞組織受損，易受微生物污染 [2] ,鮮切蓮藕的高濕度和高營養促進微生物生長繁殖。因此，要想控制鮮切蓮藕的微生物的生長繁殖，必須探究促使鮮切蓮藕脹袋的微生物菌群，也進一步揭示那些在常規的真空包裝貯藏過程中難以有效控制的微生物種群，從而為尋找新的保鮮措施奠定良好的基礎。

 國內外有較多關于肉制品中脹袋微生物分離鑒定的報道，如 Brightwell 等 [3] 從脹袋的真空包裝羊肉中分離出的嗜冷腸桿菌；Silva 等 [4] 從脹袋的巴西真空包裝牛肉中分離出的嗜冷梭狀芽胞桿菌。劉常金等 [5] 從脹袋的燒雞中分離出綠膿假單胞菌。徐世明等 [6] 從脹袋的烤雞中分離生孢梭狀桿菌、枯草芽孢桿菌和短小芽孢桿菌是等腐敗菌。國內楊穎等 [7] 研究發現朗比克假絲酵母與藤黃微球菌是導致脆梅脹袋的主要微生物。但是對于引起鮮藕片脹袋的特定腐敗微生物的研究鮮見報道。

目前，對于細菌和酵母菌的鑒定方法從傳統的生化鑒定，分子生物學方法，API 和 VITEK 等智能鑒定系統，都實現了對菌種鑒定的高度準確率。而前兩種方法操作復雜，費時，常采用一對一符合式鑒定模式，難以實現食品中快速檢測的需求，而 VITEK 2 Compact 菌種鑒定系統不僅克服了傳統菌種鑒定費時、操作要求高的缺點，而且也有較高的鑒定準確率和較好的集成性 [8] .喬寧等 [9] 利用該系統對 20 株常規細菌的鑒定符合率為 .

 本研究旨在分離鑒定促使鮮切蓮藕真空包裝脹袋的微生物樣本運用梅里埃 VITEK 2 Compact 菌種鑒定系統對所有的分離株進行鑒定，進而確定促使鮮切蓮藕真空包裝脹袋微生物種群。

1  材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗樣品 “3735”蓮藕 購于華中農業大學菜場。

 1.1.2 培養基 用于細菌和真菌分離培養的培養基營養瓊脂培養基和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基，青島高科園海博生物技術有限公司；MRS 培養基：蛋白胨 10.0g,牛肉浸膏 10.0g,酵母浸膏 5.0g,葡萄糖 20.0 g, 吐溫 80 1.0 g,磷酸氫二鉀 2.0 g,乙酸鈉 5.0 g,檸檬酸三銨 2.0 g,水合硫酸鎂（MgSO 4 ·7H 2 O）0.5 g,水合硫酸錳（MnSO 4 ·4H 2 O）0.05 g,蒸餾水 1 L,pH 6.0~6.5[ 10 ]

1.1.3 試劑 革蘭氏染色液，美蘭染色液，孔雀綠染色液，生理鹽水，75%酒精

1.2 儀器與設備

 VITEK 2 Compact 全自動微生物分析系統儀 配有革蘭陰性菌、 需氧芽孢桿菌和酵母菌鑒定卡 法國生物梅里埃中國有限公司；DZ-500K 型真空（充氣）包裝機 上海申越包裝機械制造有限公司；AR2140 型分析天平 上海梅特勒-托利多儀器有限公司；SPX-250B 型生化培養箱 天津市泰斯特儀器有限公司；DEM 光學顯微鏡 上海徠卡顯微系統有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 鮮切藕片的制備

 新鮮蓮藕經清洗，切分（8mm）后進行真空包裝（PA/PE 復合袋） ,每袋放置 6 片大小均一（直徑 7cm-8cm）的藕片置于 37℃恒溫箱內培養，收集脹袋樣本以備后續分離。

1.3.2 脹袋微生物的分離與純化

 從脹袋的藕片包裝中以無菌操作方法稱取 25g, 加入盛有 225 mL 無菌生理鹽水（0.85%）的三角瓶中， 振搖混勻， 再以無菌生理鹽水依次進行 10 倍的梯度稀釋 [11] . 取 10 -5 、 10 -6 、 10 -7 稀釋液各 0.1ml分別涂布于 MRS、PDA、營養瓊脂培養基平板上， （為抑制細菌的污染，先在 200mLPDA 培養基中加入 lmL100mg/mL 經過濾除菌的頭抱霉素和 2-3 滴 25%的乳酸， 再倒平板） 分別于 37℃ （48h） 25 ℃（72h） ,37℃（24h）進行厭氧（燭缸法）和好氧培養。觀察并記錄主要脹袋菌的菌落特征，挑取優勢單菌落分離純化（劃線 3 次以上） [12] ,接種到試管斜面于 4℃冰箱保存備用。

1.3.3 微生物反證實驗

 將分離純化的菌株分別接種于斜面，用無菌生理鹽水制備成 10 6 -10 7 CFU/mL 濃度的菌懸液，分別接種到已經滅菌的藕片（用 95%乙醇浸泡 3min,再用無菌水沖洗 4-5 次）然后進行真空包裝封袋，放置于 37℃的培養箱 7 天，觀察是否有脹袋現象。每個菌種做 3 個平行，沒有接種的無菌藕片（用無菌水浸泡 5min）作為陰性對照。

1.3.3 鏡檢

細菌：取 1 環斜面培養物進行革蘭氏染色 [10] ,觀察個體形態和純度。

酵母菌：（1）形態觀察：生理鹽水浸片法 [10] ;

（2）繁殖方式：美蘭染色法 [13] ;

 （3）假菌絲觀察 [13-14] ;在培養皿中倒一薄層 PDA 培養基，凝固后倒置數小時使表面干燥并

 活化 3 代后的菌株呈“Z”字形劃線接種。25℃培養 1 天后，在新長出的少量菌體上輕輕覆蓋滅菌蓋

 玻片并繼續培養。培養 3-5 天后，用無菌鑷子取下蓋玻片放于劃線兩旁的缺氧區域是否形成假菌絲。

（4）子囊孢子觀察 [10] ;孔雀綠芽孢染色法；

1.3.4 菌種鑒定

細菌和酵母菌鑒定均采用 VITEK 2 Compact 全自動微生物分析系統鑒定。

2 結果與分析

2.1 脹袋微生物的分離純化及菌種返接藕片的腐敗性觀察

 真空包裝的鮮切藕片在 37℃貯藏 2 天出現嚴重的脹袋情況，在第二天進行分離，采用平板計數法，結果在 10 -7 稀釋液涂布的平板上三種培養基上均有菌落產生。其中在 NA 培養基上有 8 個典型菌株，在 MRS 培養基上有 3 個典型菌株，在 PDA 培養基上有 7 個典型菌株。分別以 N1-N8,L1-L3和 Y1-Y7 表示，采用平板劃線法進一步分離純化，進行反證實驗，結果見表 1.

 由表 1 可知：接種后的藕片貯藏 7 天后，所有接種的藕片都出現了酸味，也有不同程度的軟化，表示分離的這幾種菌都有不同程度的致腐作用；N2、N6、Y1、Y3、Y4 都出現了嚴重脹袋現象（3 個平行都脹袋），打開包裝袋可以聞到強烈的酸味，也有不同程度的軟化。而其它接種的藕片和對照藕片放置 7d 后仍然保持真空包裝的狀態，因此可以斷定 N2、N6、Y1、Y3、Y4 是引起藕片脹袋的主要菌株。

2.2 菌株的形態特征及腐敗菌的鑒定

 經過反證實驗后，N2、N6、Y1、Y3、Y4,這 5 個菌株的菌落形態特征和細胞形態特征見表 2,5 個菌株的顯微形態見圖 1.

 綜合形態特性與生理生化特性，根據伯杰氏菌種鑒定手冊[ 15 ] 和酵母菌的特征與鑒定手冊 [ 14 ] ,結合 VITEK 2 Compact 的鑒定結果，進一步確定這 5 種菌分別為陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae） 、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus） 、季也蒙假絲酵母（ C. guilliermondii ） 、無名假絲酵母（C. famate）和葡萄牙假絲酵母（C. iusitaniae） .

 真空包裝鮮切果蔬制品目前已經很普遍，因為微生物污染，在貯藏期間，鮮切果蔬會出現腐敗和脹袋是兩個比較嚴重的問題，而很多研究也只針對于腐敗問題對其致腐微生物進行分離及鑒定。如趙國嬌 [16] 等對真空包裝的鮮切紫薯的菌相進行研究，發現整個貯藏過程中酵母菌數量優勢明顯；方蘭蘭[17] 等對真空包裝鮮切蓮藕中微生物進行分析，通過不同選擇性的細菌培養基分離出 7 種細菌。本文

 真空包裝鮮切藕片脹袋微生物的分離與鑒定作為探討真空包裝鮮切果蔬脹袋問題的依據，將為抑菌并延長真空包裝鮮切藕片保質期提供參考。

3 討論

 本文以脹袋的真空包裝鮮切藕片為材料進行平板劃線分離純化，得到8株細菌，3株乳酸菌和 7株酵母菌。為了驗證這 18 株微生物是否為藕片的脹袋微生物，對其進行了反證實驗，結果表明：2 株細菌、3 株酵母菌可以造成藕片的脹袋。細菌和酵母菌在 2d 內可以有一定程度的脹袋，7d 達到了嚴重的脹袋還伴有酸臭味。

 對反證實驗的菌株進行鑒定，發現 2 株細菌分別為陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae） 、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）， 3 株酵母菌都屬于假絲酵母屬（Candida） .陰溝腸桿菌廣泛存在于自然界中，在人和動物的糞便水、泥土、植物中均可檢出，是腸道正常菌種之一，為條件致病菌。該菌能利用大多數碳水化合物在 37℃發酵產氣，甘油或肌醇發酵不產氣

 [ 15 ] .蠟狀芽孢桿菌蠟樣芽孢桿菌分布很廣，土壤、空氣等均有分布，在植物性食品和許多生熟食品中也常見，可致食物腐敗和引起中毒

 [ 18 ] .對葡萄糖發酵的主要產物包括 2,3-丁二醇、乙酰基甲基甲醇、甘油、乳酸、琥珀酸、甲酸、乙酸和 CO 2 ,產物因培養條件而不同

 [ 15 ] .分離的三種酵母季也蒙假絲酵母，無名假絲酵母和葡萄牙假絲酵母都屬于假絲酵母屬，耐高滲透壓，許多種可發酵葡萄糖和其他糖類，能夠將糖轉化為酒精和 CO 2

 [ 19 ] .這與劉翠云 [20] 在氣調包裝的蓮藕中分離出引起脹袋的酵母菌有一定的一致性。在真空包裝的肉禽產品中，芽孢桿菌、 腸細菌和假絲酵母屬都是常檢出微生物

 [ 21 ] . 如高鵬等 [22] 研究出芽孢桿菌屬和梭狀芽孢桿菌屬細菌的存在可能是引起真空包裝肘花脹袋從而使產品變質的主要原因； 黃玲等

[ 23 ] 從脹袋番茄醬中分離出季也蒙假絲酵母；王向陽

 [ 24 ] 等從脹袋腌蘿卜干中分離出了蠟樣芽孢桿菌；王宏勛 [ 25 ] 等以真空包裝土豆研究了真空包裝凈菜的菌相組成，表明酵母菌是凈菜初始微生物中數量占優勢的一種優勢菌。雖然肉制品、醬制品和腌制品與鮮切果蔬加工工藝不盡相同，但由于其營養成分的相似都給微生物提供了適宜生長的環境，也導致了這些微生物代謝產生氣體最終導致脹袋。這驗證了這 5 種菌確實有導致脹袋的情況發生。

 真空包裝的鮮切藕片的制作經歷了蓮藕采摘、貯藏、清洗、去皮、切片、包裝這幾個步驟，為了減少人為增加的微生物污染，蓮藕在去皮、切片、包裝整個過程都是采用無菌操作，因此，可推斷，水源和蓮藕自帶的微生物是導致真空包裝鮮切藕片脹袋的根源，又由于蓮藕中含有水分、蛋白質、糖分以及少量的維生素和其他有機物，在適宜的溫度貯藏下為細菌和酵母菌的生長創造了有利條件。本文通過分析鮮切藕片的脹袋微生物，為下一步進行脹袋微生物的溯源提供了依據，有助于尋找確切的污染源頭，在貯藏過程中加以重點控制，加強產品品質提供保障。

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