影響凱氏定氮法測定含量準確性應注意的細節問題

摘 要：蛋白質是人體生命活動和生存所需的重要有機化合物，隨著現代人對食品的營養需求、安全程度的不斷提高，對蛋白質食品的含量評判至關重要，這離不開必要的檢測手段，目前常用的方法（GB5009.5-2010）有凱氏定氮法、分光光度法、燃燒法等，但對一般實驗室，且易于實施的仍然是法--凱氏定氮法。該方法優點是：易于實現、簡單可行，且測試準確度較高，但是該方法存在著檢測過程較繁瑣、費時、關鍵點控制不準等缺陷，所以，測定時除嚴格按照標準程序操作外，還需要一定的實驗技巧和實踐經驗。不少實驗室在實際操作過程中出現各種問題，導致檢測結果異常而不知如何去分析。本文影響凱氏定氮的因素及細節問題和大家共同探討。

關 鍵 詞：凱氏定氮；蛋白質；測定；準確性

 1.試劑配制方面。所用的化學試劑均為化學純，試劑配制把握的原則是快、準、穩，“快” 即速度快、熟練；“準”即試劑稱取量把握的準；“穩”即稱取試劑過程中不能因為追求速度，導致發生試劑散落、液體流淌等情況；目的是減少各過程間的銜接時間，避免試劑與空氣接觸時間過長引起不必要的微量變化；同時，要以少配為原則，以防使用時間過長，水分蒸發，導致試劑有效成分不足等現象。

 2.試樣的選取和制備。所采集的樣品必須具有代表性，避免受人為和主觀因素的影響。所采集的樣品必須及時進行分析，固體或半固體樣品可適當的絞碎，用物理的方法將其盡可能小化處理，對于液體只需要按照標準吸取或稱重一定量的溶液即可。為保證分析結果的準確性，在分析過程中應根據試樣蛋白質含量的高低來決定所稱試樣的重量，如遇蛋白質含量較高的食品，稱量的樣品量可少一點；遇蛋白質含量低的食品，可適當提高稱取量，原則是在稱取量范圍內合理稱取。

 3.消化過程的控制。首先是添加劑用量，國標為0.2g硫酸銅和6g無水硫酸鉀（或無水硫酸鈉），比例為1:30.若添加量加大，消化液易結塊不易轉移；添加量減少，消化時間加長或者消化不完全。濃硫酸的用量應視試樣的重量、含水量及其所含蛋白高低而適當調整。對于體積大重量輕的食品、高蛋白或者含水量較高的試樣、淀粉含量多的試樣，應適當加大濃硫酸的用量，這是由于此類樣品在消化時，濃硫酸在對其脫水和碳化時消耗量加大，當加入的濃硫酸量不足或者剛剛夠試樣脫水或碳化時會出現燒干現象。

 消化溫度，可采取逐步加熱的方式，起初可低溫（200~300℃）加熱，待試樣焦化泡沫消失后，逐步緩慢提高溫度（360~600℃）。消化液轉移及定容時，應注意：轉移，可在容量瓶口上加上漏斗，且要用少量蒸餾水多次洗滌燒瓶和漏斗（即采用少量多次原則），降低因偶然誤差而導致測定結果偏低情況。轉移完成后不要立即定容，應冷卻至室溫后再定容。

 4.蒸餾過程的準備和控制及滴定。首先，蒸汽發生器內的水的體積應控制在其容積的2/3左右，保持水呈酸性，在蒸餾操作開始前，一定要檢查一下蒸餾裝置的氣密性，在檢查氣密性的同時還應打開冷凝水開關且要保持一定的流速，否則會導致冷卻不完全。

其次，在移取試樣分解液前先把容量瓶搖勻，把移液管用試樣分解液潤洗2~3次后，再進行移取。

 據賈艷玲和冷柏忠（2000）實踐證明：蒸餾速度一般應控制在每分鐘蒸餾出液體在5~7ml之間。

 蒸餾時間一般以5min左右為宜，加入試樣分解液及氫氧化鈉后蒸餾4min,使冷凝管末端離開硼酸液面后再蒸餾1min.但是標準中并未規定從何時開始計時，據謝文飛 （2003）的實驗證明，在蒸餾完4分鐘后再多蒸餾1~2min對結果沒有什么影響，所以可以從硼酸剛剛出現綠色時開始計時蒸餾4min（硼酸出現綠色說 明反映已經開始）。最終在4分鐘后是否蒸餾完全可用PH試紙進行檢測。

 滴定是整個實驗過程的一步，至關重要，否則整個實驗將前功盡棄。滴定前把鹽酸或硫酸標液瓶搖勻后，把酸式滴定管潤洗2~3次后加入鹽酸標液排除氣泡，記下刻度值，開始滴定。滴定時一定要控制好滴定速度，待接收液由淺綠色逐漸變成無色時要放慢滴定速度，逐滴加入鹽酸標液，接收液變成淺紅色時為滴定終點，切勿滴過量。

 5.空白測定。另取凱氏燒瓶或者消化管兩個，除不加入試樣質量，每個試劑的加入量與試樣消化時的加入量相同，加熱消化至溶液呈透明的藍綠色，其后的操作步驟完全相同。從經驗來講，空白測定并不需要每次都做，隔一段時間操作一次也可以，但是在更換藥品試劑、標準溶液時必須要做空白實驗測定。若空白值超標，一般是由于所用試劑級別不夠或不純、蒸餾水不純、玻璃器皿清洗不干凈等原因造成， 必須仔細分析原因。

 以上是本人用凱氏定氮法（GB5009.5-2010）測定食品中蛋白質含量的一些淺顯的體會、經驗，不足之處，與大家共同學習探討。

參考文獻：

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 [04] 謝文飛。凱氏定氮法測定食品蛋白質的注意細節[J].食品廣角，2003（14）：17~18.

 [05] 賈艷玲，冷柏忠。減少食品中蛋白質質測定誤差的途徑[J].中國食品，2000（18）：27.