β-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的研究

β-半乳糖苷酶的研究進展

 β-半乳糖苷酶來源及作用機理。β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）普遍存在于動物（幼小動物的腸中）、植物（杏、蘋果等）及微生物（細菌、霉菌等）中，能夠將乳糖水解為葡萄糖及半乳糖供生物體代謝使用。在生物體體內，β-半乳糖苷酶是由LacZ 基因編碼翻譯而成的蛋白質酶類，通過提取動物、植物及微生物中的乳糖酶蛋白，發現來自于不同物種體內的蛋白同源性較高，進而對乳糖酶基因進行深入分類研究，并建立了β-半乳糖苷酶基因庫，其中大部分基因均來自于細菌 [1].在現今的乳糖酶應用過程中，主要利用也是微生物中提取得到的乳糖酶，其中尤以來自于酵母的乳糖酶類應用最廣，如乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis）、脆壁克魯維酵母（ Kluyveromyces fragilis ）、黑曲霉（Aspergillus niger）等。

 乳糖酶能催化發生水解反應，轉半乳糖苷反應及合成低聚半乳糖反應。催化機制主要取決于酶受體種類，當受體是水時，則發生水解反應，受體是糖或醇時，乳糖酶與受體發生轉半乳糖反應，當作用于乳糖時，則催化合成低聚半乳糖。經研究發現，乳糖酶發生催化機制主要是因為乳糖酶上存在Cys 的巰基和 His 的咪唑基，這兩者不僅可以使半乳糖苷的氧原子質子化，也通過作用于半乳糖分子首位碳原子，形成中間物，從而進一步對乳糖水解。

 β-半乳糖苷酶的應用。19世紀末，由Beijerincek發現并報道β-半乳糖苷酶能水解乳糖，乳糖酶的最初應用也是利用其水解乳糖的性質來降低乳制品中的乳糖含量。

 在食品上的應用主要為：⑴世界上超過一半的成年人因缺乏乳糖酶不能降解乳制品中的乳糖而出現乳糖不耐受，在我國這種現象更加普遍。乳糖酶的利用能水解乳制品中70%~80%乳糖，從而解決了乳糖不耐受患者的乳制品食用問題。⑵乳糖的甜度較低，不及蔗糖甜度的一半，但經乳糖酶水解后，生成的葡萄糖及半乳糖能很大程度的提高甜度，增加乳制品的適口性。⑶乳制品中的乳糖在溫度極低時，易結晶，不利于乳制品的保存，經加入乳糖水解乳可在一定程度上解決結晶的問題。⑷較普通脫脂乳，乳糖水解乳可減少酸乳凝固時間，在酸奶的制作中，省時省力，且增加酸奶口味。⑸乳糖酶將乳清中的乳清蛋白水解，不僅可以減少廢物排放，避免污染環境，乳清水解物還可制作糖漿、無害添加劑等，避免資源的浪費。⑹乳糖酶催化牛乳或乳清中的乳糖合成甜度較高、耐高溫、耐酸的低聚半乳糖。目前，國內外學者對乳糖酶催化合成低聚半乳糖的研究較多。

 低聚半乳糖的研究進展。低聚半乳糖性質及功能。低聚半乳糖（low oligosaccharide）的水溶性好，適口性好，甜度為蔗糖的20%-40%,有較好的保濕性。經熱穩定性試驗及恒溫加速試驗結果可知，當低聚半乳糖處于中性環境中，在100℃保存可1h,在120℃中可保存30min,當處于pH小于7環境中，穩定性較好，所以當低聚半乳糖在進入人體消化道后，良好的穩定性，有利于雙歧桿菌的增殖，繼而保障了人體的發育及提高免疫力。對人體健康主要從以下幾方面體現：⑴利于有益菌的增殖，平衡腸道菌群；⑵促進有機酸的生成，調節腸道酸堿度，防止便秘；⑶通過被腸道微生物發酵，促進脂肪代謝；⑷促進人體鈣的吸收，預防骨質疏松。

 低聚半乳糖的應用。根據低聚半乳糖的理化性質及功能，在食品原料中，低聚半乳糖添加入焙烤食品，既不會造成營養成分的損失，也能增加食品風味。在乳制品中添加低聚半乳糖，則可以降低乳糖含量，增加甜度。用于糖果加工、飲料加工等。

 β-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的研究進展。低聚半乳糖的合成主要是通過方法簡單且產量大的酶法合成制得，反應中的糖苷酶不僅可以催化水解糖苷鍵且能利用單糖等合成新的糖苷鍵。其中一部分糖苷酶對乳糖保持較高水解活性，能破壞底物的 β- 1 ,4 糖苷鍵并具有轉半乳糖基作用，可以以底物及水解產物合成糖苷鍵，生成低聚半乳糖。

 酶法合成途徑。1 游離酶促反應，在水溶液環境中，通過游離酶完成低聚半乳糖的合成。據相關文獻報道以質量分數為10%的乳糖為底物，以米曲霉乳糖酶為酶源，合成的低聚半乳糖收率可達70%以上，隨著乳糖濃度的改變，收率也隨之改變。通過利用細菌產生的酶與質量分數為30%的乳糖合成低聚半乳糖，收率為40%.相同質量分數的乳糖，利用雙歧桿菌產生的酶與之反應合成的低聚半乳糖收率可達47.6%.

 由此可見，游離酶促反應隨著酶的來源不同，產物收率也不同。盡管在水溶液中反應具有方法簡單、無污染的優點，但低聚半乳糖收率低，穩定性差且酶用量大，成本高的缺陷。

 非水相酶反應，因水分過多會引起體系發生水解反應，使低聚半乳糖收率降低，所以該反應體系通過降低水含量，提高了低聚半乳糖收率。據相關文獻報道通過利用含量為95%環已烷合成的低聚半乳糖收率比水溶液提高了7%.該反應體系使低聚半乳糖收率較高，但有機溶劑會影響乳糖酶活性，有機相與水相比例不當則會使乳糖酶活性明顯下降。

 固定化酶連續反應，該催化反應發生的過程是通過利用固定化酶，在CSTR或PFR的反應器中，生產低聚半乳糖。該反應體系的優點為利用的酶可以循環利用，生產的低聚半乳糖中不含利用的酶，純度高，且在酸堿環境中穩定，耐高溫，操作簡單，縮短了生產時間。

 固定化酶催化合成低聚糖的研究進展。由于固定化酶的分子結構穩固，熱穩定性高；生成的低聚糖不易被酶降解等優勢，使得該技術成為了研究熱點。秦燕等通過利用凝膠包埋質量分數為40%的乳糖且在55℃、pH為5.5的條件下制得低聚半乳糖，收率達38%,雖然收率較游離酶技術提高不大，但連續反應使相同用量的酶的催化效率得到提高，合成的產物能夠及時分離，極大降低了產物的抑制作用。王筱蘭等固定米曲霉產生的β-半乳糖苷酶，在纖維床反應器中，以底物濃度400g/L,反應溫度50℃，pH為6.0,停留時間40min,生產低聚半乳糖收率為40%.而在向反應物中加入D-半乳糖，可使低聚半乳糖收率從40%提高到60%.因為D-半乳糖是轉半乳糖苷的底物之一，能夠抑制水解反應的發生，從而促進了低聚半乳糖的合成反應，提高了收率。運用固定化酶促反應技術，不僅使低聚半乳糖的收率得到提高，而且酶的用量也逐漸降低，成本也得到了控制。同時隨著從生產材料、固定化過程及生產環節的不斷改進，生產成本還能得到更進一步的降低，具有廣闊的發展前景。

總結

 乳糖含量高限制了乳制品的消費，隨著低聚半乳糖制品的開發，不僅可以解決乳糖不耐受問題，而且能改善食品的風味、質地、色澤等品質。因此，作為一種新型的功能性食品添加劑，對低聚半乳糖生產及應用仍需進一步深入研究，使其更符合人們生活需求。

 作者簡介：劉鑫龍（1988-），男，滿族，河北承德人，助教，碩士，研究方向：生物工程；王立暉（1981-），男，副教授，碩士，研究方向：食品科學；湯衛華（1979-），女，副教授，博士，研究方向：發酵工程；殷海松（1980-），男，河北任丘人，講師，碩士，研究方向：發酵工程；孫勇民（1963-），女，教授，碩士，研究方向：生物化工。

作者單位：天津現代職業技術學院