甜杏仁和苦杏仁野黑櫻苷水解酶基因的克隆

白羽嘉 1,2,王敏 2,陶永霞 2,徐樂 3,馮作山 1*,2*

（ 1.新疆農業大學林學與園藝學院，新疆 烏魯木齊 830052;2.新疆農業大學食品科學與藥學學院，

新疆 烏魯木齊 830052:3.新疆農業科學院輪臺果樹資源圃，新疆 輪臺 841600）

摘要：以輪臺小白杏（甜杏仁品種）和甲麥黃杏（苦杏仁品種）為實驗材料，采用同源基因克隆方法克隆野黑櫻苷水解酶基因（Prunasin Hydrolase,PH）。輪臺小白杏PH基因命名為PaLTPh（GenBank登錄號：KF888615），序列長度3686bp;甲麥黃杏PH基因命名為PaMJPh（ KF888616 ），序列長度3690bp.PaLTPh和PaMJPh與扁桃PH691基因相似度為94%.根據PaLTPh和PaMJPh保守區序列設計引物，克隆CDS區序列。

 PaLTPh CDS（KF888617）和PaMJPh CDS（KF888618）序列長度均為1635bp,與扁桃Ph691全CDS區相似性為97%.PaLTPh CDS和PaMJPh CDS序列均為全長的開放閱讀框ORF,編碼蛋白質長度為544aa.PaLTPH蛋白和PaMJPH蛋白均包含長度為26aa的信號肽和糖基水解酶家族Ⅰ結構域， 可催化野黑櫻苷水解為扁桃腈和葡萄糖。杏PH基因與扁桃Ph691具有高度的同源性。

關鍵詞：輪臺小白杏、甲麥黃杏、野黑櫻苷、野黑櫻苷水解酶、基因克隆

 杏仁營養豐富，富含蛋白質、不飽和脂肪酸、維生素和礦物質 [1] ,通常被加工成杏仁油、杏仁露、鹽焗杏仁等食品 [2-3] .杏仁根據苦杏仁苷含量的多少分為甜杏仁和苦杏仁，甜杏仁中苦杏仁苷﹤0.1%,而苦杏仁中苦杏仁苷含有在 2%~4% [4-5] . 研究發現苦杏仁苷具有一定的藥理保健活性，具有鎮咳、平喘、抗炎、鎮痛、驅蟲殺菌等功效 [6] .但過量攝入苦杏仁或苦杏仁苷，則會引起食物中毒，因此苦杏仁的安全性問題受到廣泛的關注 [7-9] .

 苦杏仁苷存在于薔薇科植物杏、山杏、桃、山桃及李的種子中 [10] .苦杏仁苷（amygdalin）是一種生氰二糖苷， 結構式為苯羥基乙氰-β-D-葡萄糖-6-β-D-葡萄糖甙。 相關研究發現， 苦杏仁腈 （mandelonitrile）在 UDP-葡萄糖苷轉移酶 GT1（glucuronide transferases,GT）作用下合成野黑櫻苷，野黑櫻苷在 GT2的催化下合成苦杏仁苷 [11] ;野黑櫻苷作為苦杏仁苷的合成前體，能夠被野黑櫻苷水解酶（PrunasinHydrolases, PH） 水解生成扁桃腈和葡萄糖 [12-13] . 植物在生長發育過程中野黑櫻苷水解酶 （EC 3.2.1.21）參與了苦杏仁苷及野黑櫻苷的降解代謝，野黑櫻苷水解酶調控野黑櫻苷的濃度，進而影響苦杏仁苷的生物合成 [14-15] .相關研究鑒定出兩個在甜扁桃和苦扁桃中差異的 PH 基因（Ph691 和 Ph692），對果實發育過程中外皮、珠心、胚乳和胚中 PHs 進行組織和細胞化學定位，發現 PH 蛋白在種仁不同發育時期的質外體和共質體之間產生移動 [16] .

圖 1 苦杏仁腈、野黑櫻苷和苦杏仁苷的代謝途徑

 新疆杏果樹資源豐富，南疆環塔里木盆地周圍有大面積的栽培，是新疆特色的果樹品種之一[17] .杏果實除鮮食外，杏仁還是重要的木本糧油資源，杏仁粕含有大量的蛋白質可以被開發利用 [18] .

 新疆杏品種豐富多樣，但存在大量的苦杏仁品種，不利于食品加工和資源的綜合利用。目前苦杏仁苷的研究主要集中在提取純化 [19] 、分析檢測 [20-21] 、安全控制及生物活性等方面 [22-23] ,對苦杏仁苷形成相關基因的報道并不多見。本研究以輪臺小白杏（甜杏仁品種）和甲麥黃杏（苦杏仁品種）為實驗材料，克隆野黑櫻苷水解酶基因，對編碼蛋白質進行預測分析，有助于了解杏仁中苦杏仁苷的合成與降解途徑，為食品原料的生物檢測、遺傳育種和栽培種植提供研究基礎。

1.  材料與方法

1.1 材料與試劑

 輪臺小白杏果實（Prunus armeniaca L.cultivar LunTai Xiaobaixing,LT） 、甲麥黃杏果實（Prunusarmeniaca L.cultivar Jiamaihuangxing,MJ），于 2013 年 6 月 1 日采集自新疆農業科學院輪臺果樹資源圃（果樹種質資源輪臺果樹資源圃）。

 植物 DNA 提取試劑盒 （SK1203） 、 柱式植物總 RNA 抽提純化試劑盒、 M-MuLV First Strand cDNASynthesis Kit M-MuLV 鏈 cDNA 合成試劑盒 （BS249） 、 AMV First Strand cDNA Synthesis Kit 鏈 cDNA 合成試劑盒、LA TaqDNA 聚合酶、UNIQ-10 柱式 DNA 膠回收試劑盒（SK1131） 、T-載體 pcr產物克隆試劑盒 （SK2211） 、 感受態細胞 DH5α、 一步法制備感受態細胞溶液 （SK2301） 、 DNA Marker、6×DNA Loading Dye、溴化乙錠 上海生物工程公司；ABI SybrGreen PCR Master Mix（2X） 美國ABI 公司；瓊脂糖 西班牙 BIOWEST 公司、三羥甲基氨基甲烷、冰乙酸、鹽酸、EDTA-Na2 均為分析純 國藥集團。

1.2 儀器與設備

 LDZX-50KBS 高溫滅菌鍋 上海申安醫療器械公司；JH-SCA 凈化工作臺 上海鴻都電子科技有限公司； Biofuge Primo R 高速冷凍離心機 美國賽默飛世爾； T-100 梯度 PCR 儀 美國伯樂公司； PowerPacUniversal 電泳儀 美國伯樂公司；Sub Cell GT 水平電泳槽 美國伯樂公司；Gene Genius Bio Image 凝膠成像系統 英國 SynGene 公司；U-3010 紫外-可見分光光度計 日本 Hitachi 公司；ABI Stepone plus型熒光定量 PCR 儀 美國 ABI 公司。

1.3 方法

1.3.1 野黑櫻苷水解酶基因擴增引物設計

 參考甜仁扁桃野黑櫻苷水解酶基因序列（JQ268617.1、JQ268619.1、JQ268621.1、JQ268623.1）和苦仁扁桃野黑櫻苷水解酶基因序列（JQ268618.1、JQ268620.1、JQ268622.1、JQ268624.1） ,設計野黑櫻苷水解酶基因擴增引物 （表 1） . 引物設計擴增片段之間存在大于 200bp 堿基的重疊， 以保證 DNA拼接的準確性。

表 1  野黑櫻苷水解酶基因 PCR  擴增引物

 *注：LT1~LT 4為輪臺小白杏野黑櫻苷水解酶基因克隆引物；MJ1~MJ 4為甲麥黃杏野黑櫻苷水解酶基因克隆引物；PaPhCDS

為野黑櫻苷CDS序列 PCR引物

1.3.2野黑櫻苷水解酶基因的克隆

 取新鮮杏種仁液氮研磨，按植物DNA提取試劑盒說明書提取基因組DNA.PCR反應體系總體積25uL,包括：基因組DNA模板1uL,上下游引物（10 微米）各0.5μL,dNTP （10mM） 0.2μL,2×GC Buffer I12.5uL,ddH 2 O 10.1uL LA TaqDNA聚合酶（5U/μL） 0.2μL.PCR反應條件為：95℃，3min 94℃，30s、Tm℃，30s、72℃，90s（33個循環） 72℃，7min.PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

 PCR產物電泳后采用試劑盒回收純化DNA. 連接到pMD18-T載體，連接反應體系10.0?l,包括Solution I 4?l,PCR 產物 5?l,pMD18-T 0.2?l,H 2 O 0.8?l,16℃連接過夜。轉化感受態細胞，倒置培養過夜。挑取陽性菌落，委托生工生物工程（上海）有限公司進行測序。

1.3.3杏野黑櫻苷水解酶cDNA序列的克隆

 取新鮮杏種仁液氮研磨，按柱式植物總RNA抽提純化試劑盒方法提取總RNA.cDNA鏈合成按試劑盒說明書進行。PCR擴增體系及克隆測序同1.3.1.

1.3.3 生物信息分析

序列拼接：克隆測序采用雙向測序獲得DNA片段序列，采用DNAMAN軟件對序列進行拼接。

 核酸生物信息分析：引物設計使用軟件Primer Premier 5.0,序列拼接及比對分析使用DNAMANv7.0軟件，序列檢索通過在線NCBI進行，進化樹構建使用MEAG 5.05軟件。

 蛋白生物信息分析：ORF分析使用ORF Finder在線分析，蛋白質結構預測使用SMART（SimpleModular Architecture Research Tool,SMART）在線分析 [24] ,蛋白質結構域使用Pfam 27.0 （March 2013,14831 families）進行在線分析 [25] ,信號肽的預測分析使用 SignalP 4.1 Server在線進行。

2  結果與分析

2.1 野黑櫻苷水解酶基因的克隆

 輪臺小白杏基因組4對引物（LT1~LT4）分別擴增出1200bp、1500bp、350bp、1500bp的DNA片段，克隆測序后拼接獲得長度為3686bp的DNA序列；甲麥黃杏基因組3對引物均擴增出1500bp大小的DNA片段，克隆測序后拼接獲得長度為3690bp的DNA序列（圖2） .

 BLASTn鑒定核酸序列為野黑櫻苷水解酶基因（表2） .輪臺小白杏野黑櫻苷水解酶基因PaLTPh（Pruns armeniana LT Prunasin Hydrolase, PaLTPh）與扁桃Ph691基因（JQ268617.1、JQ268618.1）相似性為94%,與扁桃Ph692（JQ268619.1 、JQ268620.1）相似性為83%;甲麥黃杏野黑櫻苷水解酶基因PaMJPh（Pruns armeniana MJ Prunasin Hydrolase, PaMJPh）與扁桃Ph691基因（JQ268617.1、JQ268618.1）相似性為94%,與扁桃Ph692（JQ268619.1、JQ268620.1）相似性為分別為87%和83%.

 注：M 為 DNA 標準分子質量；LT1~LT4 為輪臺小白杏樣品；MJ1~MJ3 為甲麥黃杏樣品。

2.2 輪臺小白杏與甲麥黃杏野黑櫻苷水解酶 CDS 序列的克隆

 根據野黑櫻苷水解酶基因序列的保守型設計引物 PaPH CDS（表 1） ,以杏種仁 cDNA 為模板，克隆全 CDS 區序列。輪臺小白杏和甲麥黃杏 cDNA 均擴增出 1600bp 左右的 DNA 片段，克隆測序后獲得輪臺小白杏PaLTPH CDS序列和甲麥黃杏PaMJPH CDS序列 （圖3） . PaLTPh CDS和PaMJPh CDS序列長度均為 1635bp,BLASTn 檢索鑒定與扁桃 Ph691 完整 CDS 序列（JQ268622.1、JQ268621.1）相似性為 97%.

 根據PaLTPh CDS和PaMJPh CDS序列BLASTn搜索同源性較高的核酸序列，包括：扁桃（Prunusdulcis） 、 美國黑櫻 （Prunus serotina） 、 甜櫻桃 （Prunus avium） 、 蘋果 （Malus x domestica） 、 草莓 （Fragaria）等物種的Phs.構建上述物種的核苷酸序系統進化樹（圖4），不同物種的野黑櫻苷水解酶基因可分為4類， 扁桃Ph691和杏聚為一類， 美國黑櫻和甜櫻桃聚為一類， 蘋果和草莓單獨各聚為一類。 但扁桃Ph692較為特殊，進化分析中扁桃Ph692并沒有與扁桃Ph691和杏聚為一類，而是進化為美國黑櫻中的一個獨立分支。

 PaLTPh CDS 和 PaMJPh CDS 存在堿基差異（圖 5） ,主要表現為轉換（A-G/C-G）和顛換（A-C/G-T） ,未出現堿基缺失和插入。參考扁桃 Ph691 和 Ph692 序列進一步比對，發現杏 Ph 基因CDS 與扁桃 Ph691 CDS（JQ268621.1、JQ268622.1）核苷酸的差異表現為轉換和顛換，與扁桃 Ph692CDS （JQ268623.1、 JQ268624.1） 核苷酸的差異則出現了堿基的插入 （序列位置： 1084-1086、 1103-110、1683-1643）和缺失（位置：80-82、1302-1307） .堿基的插入和缺失會導致該基因所翻譯的蛋白質產生較大的差異。

2.3 杏野黑櫻苷水解酶預測蛋白及分析

 使用 NCBI 中 ORF Finder 軟件對序列分析（圖 6,圖 7） ,PaLTPH CDS 序列和 PaMJPH CDS 序列包含起始密碼子和終止密碼子，為全長的開放閱讀框 ORF（open reading frame,ORF） ,編碼蛋白質長度為 544aa,兩者相似性為 97.06%.

 使用 Pfam 27.0 對編碼蛋白序列進行分析（圖 8）， PaLTPH 和 PaMJPH 均包含一個長度為 26aa（氨基酸殘基 1-26aa）的信號肽及糖基水解酶家族Ⅰ（Pfam:Glyco_hydro_1）結構域。

 在線 SignalP 4.1 Server 對蛋白序列信號肽進行預測分析（圖 9、圖 10） ,PaLTPH 和 PaMJPH 在1-26aa 序列 S 值較高（S-score），預測該氨基酸序列為信號肽。PaLTPH 信號肽序列 為MALQFRSLLLCVVLLLLGFSLANTNA , PaMJPH 信 號 肽 序 列 為MALQFRSLLLCVVLFLLGFALANTNA,比較發現第 13 個氨基酸殘基（由 Ile 變成 Phe）和第 19 個氨基酸殘基 （由 Ser 變成 Ala） 存在差異 （圖 13） . 參考比對扁桃 PH 691 蛋白 （AFH35014.1、 AFH35015.1）信號肽發現，4 個蛋白的信號肽在 11、13 和 19 氨基酸殘基存在差異。對比 CDS 序列分析，發現這種差異是由于核苷酸堿基 33、42、44、57、59 發生改變引起的。

 信號肽在蛋白質的合成和轉運過程中有重要的作用。編碼分泌蛋白的 mRNA 在翻譯時首先合成的是 N 末端帶有疏水氨基酸殘基的信號肽，它被內質網膜上的受體識別并與之相結合；信號肽經由膜中蛋白質形成的孔道到達內質網內腔，隨即被位于腔表面的信號肽酶水解，由于它的引導，新生的多肽能夠通過內質網膜進入腔內，最終被分泌到胞外；翻譯結束后，核糖體亞基解聚、孔道消失，內質網膜又恢復原先的脂雙層結構 [26-28] .杏種仁和扁桃種仁中野黑櫻苷水解酶含有信號肽，相似性為96.15%,野黑櫻苷水解酶最終分泌到胞外，參與野黑櫻苷的代謝。

 野黑櫻苷水解酶屬 O-糖基水解酶（EC 3.2.1.） ,O-糖基水解酶是一個廣泛的水解酶家族，能水解兩個 （或兩個以上） 糖形成的糖苷鍵， 或水解糖與非糖基團所形成的化學鍵， 生成單糖及非糖組分 [29] .對 PaLTPH 和 PaMJPH 的 Glyco_hydro_1 結構域進行分析（表 3），PaLTPH、PaMJPH 與 AFH35014.1、AFH35015.1同屬于Glycosyl hydrolase family 1蛋白家族， HMM的長度為455aa, 預測活性位點為210aa和 426aa.杏與扁桃野黑櫻苷水解酶蛋白具有高度相似的結構域及活性位點，推測杏種仁與扁桃種仁中野黑櫻苷水解在苦杏仁苷的合成與代謝調控中起到相似的作用。

3 結論與討論

 3.1 采用同源基因克隆的方法從輪臺小白杏中克隆獲得PaLTPh,序列長度3686bp;從甲麥黃杏中克隆獲得PaMJPh,序列長度3690bp.PaLTPh和PaMJPh與扁桃PH691基因相似度為94%,具有高度的同源性。

 3.2 利用PaLTPh和PaMJPh序列的設計引物，以杏種仁cDNA為模板，克隆CDS區序列。PaLTPh CDS和PaMJPh CDS序列長度均為1635bp, 與扁桃Ph691全CDS區 （JQ268622.1、 JQ268621.1） 相似性為97%.3.3 PaLTPh CDS和PaMJPh CDS序列均包含起始密碼子和終止密碼子，為全長的開放閱讀框ORF,編碼蛋白質長度為544aa.PaLTPH蛋白和PaMJPH蛋白均包含長度為26aa的信號肽和糖基水解酶家族Ⅰ（Pfam:Glyco_hydro_1）結構域，可催化野黑櫻苷水解為扁桃腈和葡萄糖。

 扁桃和杏同屬薔薇科核果類果樹，其苦仁中所含的苦味物質都是苦杏仁苷。研究利用扁桃野黑櫻苷水解酶基因，進行同源克隆，獲得杏仁中野黑櫻苷水解酶基因（PaLTPh、PaMJPh） ,其基因序列與扁桃Ph691基因（JQ268617.1、JQ268618.1）相似性更高，蛋白預測分析顯示其相似性為98.67,同屬于Glyco_hydro_1家族。野黑櫻苷水解酶作為苦杏仁苷合成關鍵基因，已從美洲黑櫻（Prunus serotina）[30-32] , 甜櫻桃 （Prunus avium） [33-34] 及扁桃 （Prunus dulcis） 中克隆到相關的基因， 隨著桃 （Prunus persica）基因組測序與組裝的完成，也預測出野黑櫻苷水解酶相關基因 [35-37] .從杏種仁中克隆野黑櫻苷水解酶基因，豐富了其基因的多樣性，對杏仁種在發育過程中Ph基因的表達情況、細胞化學定位還有待于深入的研究。

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