采用GC/MS方法檢測蘋果汁和蘋果酒中的天然棒曲霉素

□ Pat Sasso 安捷倫科技有限公司

 隨著蘋果生長期的延長以及蘋果和蘋果濃縮汁出口能力的提高，它們攝入污染產品的可能性也隨之增加。棒曲霉素是一種真菌霉素，在蘋果腐爛過程中產生。本文描述了一種采用安捷倫超高惰性色譜柱檢測棒曲霉素的方法，該方法無需樣品衍生化。該色譜分析方法可以分離5-羥甲級糠醛（HMF），它是一種由蘋果產品中的糖在過度加熱時生成的產物。使用聚苯乙烯-二乙烯苯SPE柱執行固相萃取，然后在注入GC/MS系統檢測前用乙酸乙酯進行液/液萃取，完成樣品制備。

 蘋果酒和蘋果汁是全球十大消費量的水果飲料之一。蘋果以及蘋果產品的三大生產國分別是中國、美國和波蘭。這三個蘋果產區的氣候條件非常適合多種蘋果的生長。市售蘋果汁經由過濾、巴氏消毒以及真空包裝等工序加工而成，口味獨特、氣味芳香、保質期長。棒曲霉素來源于青霉素霉菌，包裝產品要求盡量避免棒曲霉素的產生，其含量被控制在10ng/g以內。在果汁生產過程中對棒曲霉素的檢測方法有很多，包括HPLC/UV方法、GC方法以及GC/MS方法，這些方法有些需要衍生，有些無需衍生。盡管這些方法都經濟可靠，但如何分離棒曲霉素與HMF對于反相HPLC方法來說還是一個難題。不過，可以通過LC/MS/MS方法來驗證兩者是否成功分離。在鮮蘋果汁的生產過程中，因為加工步驟的關系，果汁中會含有果膠，果膠能夠降低血清膽固醇從而增加果汁的健康價值。然而，這種簡化的加工方法增加了縮短保質期的風險，棒曲霉素產生的可能性也將顯著提高。

材料與方法

 將Agilent 7890A GC與配備有惰性EI 350℃無涂層離子源的Agilent 5975C質譜儀聯用。Agilent J&W DB-35ms UI色譜柱安裝在多模式進樣口（MMI）上，采用冷-不分流模式以獲取樣品傳輸。棒曲霉素以及HMF購自Sigma-Aldrich公司，濃度為100μg/mL（棒曲霉素）或純品（HMF）。

分析條件

標樣

 將乙酸乙酯作為溶劑，配置濃度范圍10~1000ng/g的棒曲霉素和HMF混合標準溶液，用于測定線性和檢測限。將購買的蘋果汁和蘋果酒冷藏保存。在初步篩選后，使用空白提取物做稀釋溶劑來制備與樣品基質相匹配的校準組。

樣品制備

1.稱取10g（10mL）的蘋果汁或蘋果酒置于潔凈的容器中。

2.向樣品中添加10ng/g（10ppb）的標樣用以測定標樣在果汁中的回收率。

3.依次用4mL甲醇、4mL HPLC級的去離子水平衡SPE管。

 4.向經過預平衡的SPE柱加10mL樣品，讓樣品自然流出（根據樣品的澄清度，蘋果酒可能需要稍微抽一下真空）。

5.在常壓下用8mL 1%的碳酸氫鈉水溶液淋洗柱子。

6.在常壓下用8mL 1%的醋酸水溶液淋洗柱子。

7.用收集管替換廢液管。

8.在常壓下用8mL HPLC級的甲醇進行洗脫。

9.用溫水浴干燥洗脫液來除去甲醇，干燥至余下大約4mL的水溶液。

10.用3mL乙酸乙酯對洗脫液進行液/液萃取（3次），合并萃取液并收集于錐形管中待干燥。

11.將乙酸乙酯萃取液干燥至1mL,轉移至自動進樣瓶中待進樣。

結果與討論

圖1是10ng/g HMF與棒曲霉素混合物的全掃描色譜圖。峰形理想、基質背景干擾少。

 加標樣品的回收率大于90%,說明Bond Elut LMS SPE可用于低濃度樣品的分離。萃取步驟將會去除果汁中所含有的10%的糖類物質，因為它們會在短時間內污染進樣器，使得進樣口的維護頻率增加。被去除的還有大量維生素C,因為它會與HMF一起洗脫出來，干擾色譜峰的積分。一些高沸點的溶質，如，多酚類物質會被一同萃取出來。這些高沸點物質會在進樣口積聚，在允許溫度下烘烤一段時間可被去除。本方法可以分離苯甲醛，它是一種蘋果種子腐爛時會產生的一種標志性化合物。盡管拖尾比較多，MMI模式下的峰對稱性仍可與冷柱頭進樣模式下的峰對稱性相媲美。

結論

 在使用Bond Elut LMS萃取柱以及液/液萃取制備樣品之后，Agilent J&W DB-35ms超高惰性色譜柱可以很好地分離棒曲霉素和羥甲基糠醛。如果樣品量很大，進一步的優化和自動化萃取步驟可以節省大量時間。